液相色谱-串联质谱法测定水产品中6种丁香酚类化合物残留量

◎ 钱振杰，何咏欣，龚海锟，杨嘉鑫威，张 辉，陈彦宏

（广州市食品检验所，广东 广州 511400）

随着生活水平的不断提高，人们对水产品的需求量、品质、鲜活度等方面要求也在不断提高，水产品中药物残留问题已成为人们普遍关注的重点问题。在水产品长途运输过程中，受运输密度、运输水温、水产动物挣扎等因素影响，易使水产动物代谢加快、耗氧量增大、二氧化碳排放量增加而导致其出现应激反应、感染病菌，甚至死亡[1]。因此，为提高水产品流通环节的运输存活率，麻醉剂得到了广泛使用。目前，水产业使用的麻醉剂接近30 种[2]。其中，丁香酚类麻醉剂是国内水产业中使用最多的麻醉剂种类之一，其残留情况近年来备受关注。

丁香酚类麻醉剂是由3 组同分异构体组成，即丁香酚与异丁香酚、甲基丁香酚与甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯与乙酰基异丁香酚。目前，水产业中使用丁香酚类麻醉剂的安全性备受争议。日本、新西兰、澳大利亚、智利等国允许水产业中使用丁香酚类麻醉剂，但美国国家毒理学计划认为，对于啮齿动物而言，丁香酚类化合物是致癌物或潜在致癌物，并将其列入第3 类致癌物[1-3]。

当前，丁香酚类麻醉剂残留量的测定方法主要有紫外分光光度法[4]、毛细管电泳法[5]、液相色谱法[6]、气相色谱法[7]、液相色谱-串联质谱法[3,8-9]和气相色谱-串联质谱法[10-13]等。针对水产品类复杂基质样品，光谱法和色谱法易受基质干扰影响，检测限高，灵敏度低，常用于常量分析。通过对特征碎片离子的筛选，色谱-串联质谱法能较好地解决复杂基质干扰问题。但气相色谱-串联质谱法的高温气化过程会影响丁香酚的热稳定性，并使其在96 h 后降解[14]。因此，本研究选用液相色谱-串联质谱（High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLCMS/MS）法，建立了水产品中6 种丁香酚类化合物残留量同时测定分析的方法，为进一步加强水产品食用安全性监管提供技术支撑，减少残留问题带来的食品安全隐患。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

6 种丁香酚类化合物标准品，纯度均≥95%，详见表1；甲醇、乙腈、乙酸乙酯，色谱纯；无水硫酸钠、无水硫酸镁、二甲基亚砜，分析纯；Oasis®PRiME HLB小柱，6 cc/500 mg；陶瓷均质子，50 mL tubes。

表1 6 种丁香酚类化合物的中文名称、英文名称、CAS 号、分子式和相对分子量表

1.2 仪器与设备

Shimadzu LC-30A型超高效液相色谱仪；AB SCIEX Triple Quad 5500+型三重四极杆质谱仪；Thermo Fisher Scientific ST18R 型高速离心机；Biotage turbovap LV 型浓缩氮吹仪；上海安谱2600TH 型超声清洗器；梅特勒MS204TS 型电子天平；Millipore Milli-Q 型超纯水系统。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

丁香酚类化合物标准储备液（1.00 mg·mL-1）：分别称取100.0 mg 丁香酚类化合物标准品，用乙腈溶解，并定容至100 mL。

丁香酚类化合物标准中间液（10.0 μg·mL-1）：分别吸取100 μL 丁香酚类化合物标准储备液，用乙腈稀释，并定容至10 mL。

标准系列工作液：用空白基质溶液将标准中间液稀释成浓度为20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1系列标准工作液。

1.3.2 样品制备与保存

鱼、虾：将表面杂质洗净，鱼去鳞、去皮，取可食肌肉部分，虾去壳、去头，取可食部分，试样充分均质、混匀，置于-18 ℃冷冻、保存，备用。

水样：将试样充分混匀，置于-18 ℃冷冻、保存，备用。

1.3.3 样品前处理

（1）水产品（淡水鱼、淡水虾、海水鱼及海水虾）。称取2.00 g 均质样品于50 mL 离心管中，加入10 mL乙腈和一粒陶瓷均质子，涡旋振荡10 min，超声提取15 min，加入5 g 无水硫酸钠，涡旋振荡5 min，转速5 000 r·min-1，离心5 min，转移上清液至另一50 mL离心管中，残渣用10 mL 乙腈重复提取1 次，合并2 次上清液，过Oasis®PRiME HLB 柱，收集流出液，35 ℃下氮吹至近干，用乙腈复溶并定至1 mL，过0.22 μm 微孔滤膜，上机测定。

（2）水样。称取5.00 g 混匀样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈，涡旋振荡10 min；加入5 g无水硫酸镁，涡旋振荡5 min，转速5 000 r·min-1，离心5 min；吸取4 mL 上清液，35 ℃下氮吹至近干，用乙腈复溶并定至1 mL，过0.22 μm微孔滤膜，上机测定。

1.3.4 仪器条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：Phenomenex Kinetex C18柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）； 流动相：水（A）、甲醇（B）； 流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：1.0 μL；梯度洗脱程序：0～1.0 min，50%B，1.0～5.0 min，50%B～70%B；5.0～6.0 min，70%B；6.0～8.0 min，70%B～95%B；8.0～11.0 min，95%B；11.0～11.1 min，50%B；11.1～13.0 min，50%B。

（2）质谱条件。离子源：电喷雾离子源，正/负离子切换（ESI+/ESI-）；扫描模式：多反应监测（Scheduled MRM）；电喷雾电压：5 500 V 和-4 500 V；离子源温度：550 ℃；气帘气：40 L·min-1；雾化器：60 L·min-1；辅助气压力：55 L·min-1。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的选择

6 种丁香酚类化合物结构式见图1。其中，丁香酚、异丁香酚含有酚羟基，电离过程易失去质子，形成[M-H]-准分子离子，在负离子（ESI-）模式下响应较强；其余4 种化合物的酚羟基被其他基团取代，更易获得质子，形成[M+H]+准分子离子，在正离子（ESI+）模式下响应较强。因此，本研究选用电喷雾离子源，进行正/负离子切换扫描，具体质谱参数见表2。

图1 6 种丁香酚类化合物结构式图

表2 6 种丁香酚类化合物质谱条件表

2.2 液相条件的选择

为实现同分异构体之间的有效分离，本研究比较了乙腈/水体系、甲醇/水体系和（甲醇+乙腈）/水体系作为流动相时的分离情况。结果表明，以甲醇/水体系作为流动相，即可实现3组同分异构体的基线分离，流动相简单，且峰形尖锐、对称、无拖尾，见图2。

图2 6 种丁香酚类化合物标准溶液色谱图

2.3 提取溶剂的选择

丁香酚类化合物能与醇、醚、氯仿、挥发油混溶，溶于冰醋酸和苛性碱溶液，不溶于水。本研究比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯等溶剂对6 种丁香酚类化合物的提取效果。结果表明，当使用甲醇提取时，上清液浑浊、偏黄，基质干扰严重；当使用乙酸乙酯提取时，目标峰附近存在较多杂峰干扰，同时因乙酸乙酯具有易挥发性，色谱峰基线出现较大波动，影响定量准确性；当使用乙腈提取时，基线较平稳，目标峰型尖锐，基质干扰较小。同时，乙腈对脂类溶解较少，并具有沉淀蛋白作用，配合吸水剂无水硫酸钠使用，可达到最佳提取、除杂效果。因此，最终选择乙腈进行提取。

2.4 净化方式的选择

常见的净化方式包含液-液萃取（Liquid-Liquid Extraction，LLE）、固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）和分散固相萃取（Dispersive Solid-Phase Extraction，DSPE）等。使用乙腈饱和的正己烷萃取，是常见的液-液萃取脱脂净化方式。QuEChERS 法是分散固相萃取净化的一种，常用的萃取吸附剂有C18、PSA 和GCB。C18可吸附脂类等非极性杂质，PSA 可吸附极性有机酸、糖类、脂肪酸和甾醇等杂质，GCB 可吸附色素等杂质。Oasis®PRiME HLB 是一种新型反相固相萃取柱，可省去活化、平衡步骤，试样经提取后直接上样，能去除基质中95%以上的磷脂干扰物，基质效应较小。Captiva EMR-Lipid 是一种增强型脂质去除固相萃取柱，和Oasis®PRiME HLB 类似，也具有高选择性和高效除脂的效果。

本研究比较了乙腈饱和的正己烷脱脂、C18+PSA吸附净化、C18+PSA+GCB吸附净化、Oasis®PRiME HLB固相萃取柱和Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱等净化方式对6 种丁香酚类化合物回收率的影响，结果见图3。使用乙腈饱和的正己烷脱脂，会使丁香酚和异丁香酚的回收率偏高；EMR 法会使丁香酚和异丁香酚的回收率偏低；QuEChERS 法两种吸附剂组合方式中，加入GCB 组回收率普遍偏低，不加GCB 组回收率略低于PRiME HLB 直接滤过法。因此，最终选择Oasis®PRiME HLB 固相萃取柱进行净化。

图3 净化方式对6 种丁香酚类化合物回收率影响图

2.5 浓缩方式的选择

丁香酚类麻醉剂均具有一定的挥发性。为观察其在氮吹浓缩过程中的稳定性，本研究将氮吹箱水浴温度分别设置为30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃，使5.0 mL 乙腈配制的浓度为50 ng·mL-1丁香酚类混标溶液氮吹浓缩至近干，用乙腈复溶并定至5.0 mL，考察各组分回收率情况，结果见图4。当水浴温度≤35 ℃时，6 种丁香酚类化合物回收率均相对较好，再随着水浴温度的上升，部分物质的回收率下降明显。可能是受高温影响，导致丁香酚类麻醉剂挥发、降解。加入一定量DMSO[13]，对丁香酚和异丁香酚2 种化合物有一定的保护作用，但对甲基丁香酚、甲基异丁香酚、乙酸丁香酚酯和乙酰基异丁香酚4 种化合物的回收率影响严重。综合考虑回收率情况和氮吹浓缩所需时间，最终选择水浴温度35 ℃、不加DMSO 条件下，进行氮吹浓缩。

图4 氮吹温度和DMSO 用量对6 种丁香酚类化合物回收率的影响图

2.6 方法学验证

2.6.1 线性范围、检出限与定量限

用空白基质溶液配制浓度为20～500 ng·mL-1系列标准工作液，以标准溶液浓度为横坐标、定量子离子峰面积为纵坐标进行拟合，绘制标准曲线。6 种丁香酚类化合物在20～500 ng·mL-1均具有良好的线性关系，相关系数r均≥0.998。使用空白基质溶液逐级稀释，确保6 种丁香酚类化合物信噪比（S/N）均≥3，最终确定检出限均为0.01 mg·kg-1，定量限均为0.02 mg·kg-1。

2.6.2 回收率与精密度

选取养殖水、对虾和鲫鱼为样品基质，在0.02 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1和0.10 mg·kg-13 种添加水平下，进行丁香酚类麻醉剂加标回收试验，回收率和精密度结果见表3。养殖水中，各添加水平平均回收率为72.6%～109.2%，精密度为1.1%～4.6%；对虾中，各添加水平的平均回收率为79.0%～98.9%，精密度为1.3%～7.7%；鲫鱼中，各添加水平平均回收率为82.9%～107.2%，精密度为1.4%～11.3%。由此可见，6 种丁香酚类化合物平均回收率在60%～120%，相对标准偏差均＜15%，方法准确度和精密度均可满足分析测定相关要求。

表3 水产品中6 种丁香酚类化合物平均回收率和精密度结果表（n=6）

3 结论

本研究基于液相色谱-串联质谱技术（HPLC-MS/MS），结合Oasis®PRiME HLB 固相萃取净化方式，以多反应监测（MRM）和正/负离子切换扫描模式，建立了同时测定水产品中6 种丁香酚类化合物残留量的方法。经验证，该方法简单、便捷、灵敏，适合水产品中6 种丁香酚类化合物残留量的定性、定量测定分析。运用该方法，对市售31 份鲜活水产品（含26 份鱼类和5 份虾类）进行丁香酚类麻醉剂测定，结果均为未检出。