细胞膜片在骨与软骨组织修复及再生中的研究进展

谢聪， 李里， 廖俊琳

(南华大学衡阳医学院附属第一医院 1.医疗美容科,2.妇产科,湖南省衡阳市 421001)

由创伤、肿瘤、感染、先天性畸形、退行性疾病引起的骨、软骨缺损和骨、软骨复合体缺损严重影响患者生活质量[1]。传统的组织工程技术主要包括种子细胞和生物支架的移植。近二十年来，组织工程的发展取得了重大进展，为骨和软骨缺损的再生治疗带来了新希望[2]。细胞膜片技术作为一种替代方法和一种理想的生物可降解支架材料，既能有效促进细胞黏附、增殖，又能促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM)分泌，且具有合适的力学性能。越来越多研究者将细胞膜片技术应用于骨、软骨的缺损修复和再生中，并取得良好的修复效果[3]。本文就细胞膜片的制备以及细胞膜片技术在骨与软骨组织修复及再生中的应用进行了综述。

1 细胞膜片的制备

细胞膜片的制备方法多种多样，本文将细胞膜片的制备技术分为温度敏感培养法、表面修饰法、不需要任何表面修饰法3类。

1.1 温度敏感培养法

细胞膜片最早利用温度敏感型聚异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)将细胞共价结合于细胞培养皿底部。当溶液温度高于32 ℃，PIPAAm表现出亲水性，细胞在培养皿表面贴附、生长；当溶液温度低于32 ℃时，PIPAAm表现为疏水性，细胞成片状分离出来。Akiyama等[4]将温度敏感的PIPAAm和弹性的二甲基硅氧烷相结合，当温度低于32 ℃，收缩拉伸的聚异丙基丙烯酰胺-二甲基硅氧烷并降低温度，快速地诱导细胞分离，证实双重刺激可以加速细胞膜片的脱落和收获。

1.2 表面修饰法

表面修饰法利用润湿性、pH值、光、电和磁等来诱导细胞分离。如在相应的模型上镀金，在镀金表面上形成金-硫酯键，通过施加电流来诱导细胞膜片的分离[5]。Kobayashi等[6]设计了一种两性离子寡肽来修饰金表面，其末端的半胱氨酸残基含有巯基，在金表面自发形成一个金硫酸盐键，通过施加电流，金硫酸盐键被裂解，然后寡肽层被解离吸收，从而使细胞膜片从金表面分离。光诱导细胞获取是一种快速、安全的细胞膜片的获取方法，在调节细胞黏附行为方面显示出巨大的潜力。近红外激光照射具有“生物友好性”，可提供一种独特的空间控制细胞行为的方法，并通过光热效应空间解离胶原蛋白。Kim等[7]首次描述了在不改变细胞形态的情况下从聚3,4-亚乙基二氧噻吩(PEDOT)基质上分离和收获细胞膜片。通过聚合物溶液浇铸将PEDOT直接涂覆到聚苯乙烯上，形成SP-PEDOT，并将I型胶原滴注到SP-PEDOT基质上，形成PEDOT基质(CSP-PEDOT)，再将成纤维细胞接种在胶原涂层的CSP-PEDOT上，培养3天后近红外二极管激光器照射5 min，细胞膜片从基质上分离。Long等[8]首先在石英(SiO2)衬底上制备二氧化钛纳米点(TN)薄膜，然后将单层石墨烯(Gr)转移到其表面形成Gr/TN薄膜，将细胞悬浮液接种到Gr/TN2/SiO2基质上，并在37 ℃、5%CO2下培养，用365 nm紫外线或450 nm可见光照射20 min，从Gr/TN2/SiO2表面收集到细胞膜片。Koo等[9]研究发现，用血卟啉(Hp)、聚酮(PK)聚合物按所需比例溶解于六氟-2-丙醇中，制备聚合物膜片，然后用此膜片培养细胞，用510 nm的绿色发光二极管照射Hp-PK膜后，产生外源性活性氧，诱导细胞膜片脱离。

1.3 不需要任何表面修饰法

Itabashi等[10]将纤维蛋白原单体与凝血酶混合，制备聚合人纤维蛋白涂层培养皿，将新生大鼠心肌细胞在培养皿中培养4天后形成心肌细胞膜片，心肌细胞分泌的蛋白酶降解了纤维蛋白聚合物，从而制备出心肌细胞膜片。Ito等[11]利用磁铁矿阳离子脂质体(magnetite cationic liposomes，MCLs)和细胞膜之间的静电相互作用来改善磁铁矿纳米颗粒在靶细胞中的积累。MCLs被人角质形成细胞以33 pg的磁铁矿含量吸收，细胞以2×106个细胞的密度接种到24孔的超低附着板中，将4 000 g磁铁置于孔下，培养24 h后，形成细胞膜片，当磁铁被移除时，膜片就会从膜的底部分离出来，然后用磁铁将膜片收集起来。Inui等[12]使用小鼠成肌细胞在培养基中培养，通过换能器、超声波喇叭、固定盘和移动盘的夹具和水池等组成的装置，施加交流输入诱导纵向振动，在超声变幅、换能器顶端将振动转变为高能超声波，并从超声喇叭的顶端发出，直达培养皿上的一小片细胞培养表面，使细胞成片脱落，从而制备细胞膜片，证实辐照超声可以诱导细胞分离。

2 细胞膜片在骨组织修复及再生中的应用

细胞膜片广泛应用于心脏、肝脏、肾脏、角膜、膀胱、食管、气管、肌腱、牙周组织、骨和软骨等多种组织和器官的再生。Yoshida等[13]将脂肪干细胞制备成脂肪干细胞膜片，置于12周龄大鼠股骨远端制备孔径为1 mm的骨缺损模型中，术后4周，脂肪干细胞膜片能显著加快骨缺损的愈合。Kawecki等[14]用筛窦祖细胞制造细胞膜片来刺激骨再生,将筛窦祖细胞膜片填塞植入颅骨骨缺损，8周后显微CT图像显示，骨再生得到改善。Mu等[15]将3月龄猪的下颌骨骨髓干细胞，分离培养，然后制备成3层骨髓干细胞膜片置于骨缺损处，术后6周，发现其促进骨缺损的修复与再生。细胞膜片植入骨受损区域可以恢复受损组织的完整性和功能。

因细胞膜片机械性能较差，植入相应的骨组织缺损部位时，无法形成坚硬的骨组织，所以细胞膜片用于骨组织的修复时，常常与三维支架相结合。最常见的支架材料为磷酸三钙、天然珊瑚支架等。Lin等[16]将合成的β-磷酸三钙/I型胶原复合材料三维多孔支架，与体外培养的骨髓间充质干细胞膜片相结合，植入小鼠背部，4周后新骨形成。支架植入人体相应部位后，会损害细胞间相互作用、ECM成熟、细胞活力，导致炎症发生，甚至可能对周围宿主细胞有毒，进而导致其应用受到限制。为了弥补支架植入的缺陷，制造了不诱导细胞和组织坏死的无支架的组织工程[17]。组织工程的具体方法包括使用温度响应培养皿制备预血管化细胞膜片，以及使用圆柱形玻璃模具和琼脂糖模具将细胞膜片制备成球体[18]。Xu等[19]研究表明，带血管预处理组有更多的功能性灌注血管和新的骨组织形成。Tatsuhiro等[20]将人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSC)制备成细胞膜片进行三维培养，形成直径为3～4 mm的球形结构，构建无支架hDPSC结构，并植入缺损处，结果显示，hDPSC细胞膜片结构中的骨相关基因表达水平显著上调，具有更高程度的钙化基质形成和更高的骨相关基因表达水平。更多的无支架方式有待开发，以便达到最佳治疗效果。

3 细胞膜片修复及再生骨组织的影响因素

3.1 复层细胞膜片

在骨缺损修复中，植入物的血管化是限制组织工程继续发展的重要原因之一。骨缺损修复主要通过不同细胞膜片叠加和不同细胞共培养两种方式促进细胞膜片血管化。Zhang等[21]将成骨细胞膜片和血管内皮细胞膜片组成的复层细胞膜片植入裸鼠体内的皮下移植，结果表明复层细胞膜片的成骨能力更强。

3.2 生物材料

羊膜具有独特的生物学特性，是一种良好的应用于组织工程领域的生物材料。人的羊膜由两层薄膜组成，含有许多生长因子、细胞因子和其他生物活性物质。Go等[22]在人骨肉瘤细胞培养瓶中添加含有100 mg/L羊膜提取物(amnion membrane extracts,AME)和羊膜/绒毛膜提取物(amnion/chorion membrane extracts，A/CME)的成骨诱导培养基进行培养。结果表明，A/CME能够提供生长因子等基质促进人骨肉瘤细胞的成骨分化，从而显著提高人成骨肉瘤细胞的成骨效果，人类A/CME在骨再生方面具有巨大的治疗潜力。

3.3 机械刺激

机械刺激能有效调控细胞增殖、分化等多种细胞行为。Yu等[23]证实，在机械条件下，通过循环拉伸培养多层细胞-胶原蛋白结构，各向异性图案胶原膜能有效引导小鼠成骨细胞排列，促进细胞的成骨分化。循环机械调节进一步促进了细胞的成骨分化和ECM分泌。

3.4 基因转染

基因转染技术与细胞膜片技术联合可促进成骨能力。Wang等[24]制备出壳聚糖/透明质酸纳米粒子，再应用慢病毒转染miR-21基因，然后将其诱导入人骨髓间充质干细胞膜片。结果发现，转染miR-21基因显著增强了人骨髓间充质干细胞膜片的体外成骨分化能力。

3.5 光控系统

光控方法产生的细胞膜片植入复合物比机械方法产生更多ECM[25],且ECM可以促进细胞的成骨分化，也可促进骨整合[26]。Jiang等[25]研究发现，与机械刮削制备的骨髓间充质干细胞膜片植入复合物相比，通过光控系统制造的骨髓间充质干细胞膜片植入物复合物，可以上调低密度脂蛋白受体相关蛋白5(low density lipoprotein receptor-associated protein 5，LRP5)、β-catenin和Runt相关转录因子2(Runt-associated transcription factor 2，Runx2)的表达水平。并可以通过Runx2直接结合于LRP5启动子和LRP5/β-catenin/Runx2调控环，有助于骨整合潜能的增强。因此，通过光控系统调节细胞膜片，可以加强成骨能力。

4 细胞膜片在软骨组织修复及再生中的应用

临床上因外伤、炎症等原因导致的软骨缺损存在较高的发病率。软骨缺损能导致相应区域的功能下降，而且软骨再生能力十分有限，一旦造成损伤，很难自我修复,因此，细胞膜片在软骨再生方面具有很大的发展潜力。Gultekin等[27]研究表明，骨髓间充质干细胞和软骨细胞膜片均可防止骨骺板内软骨成骨，且明显促进了软骨生长。Takahashi等[28]将人三层软骨细胞膜片卷曲移植于兔膝关节软骨缺损中，实验组可见较强的透明软骨再生。细胞膜片技术也可通过细胞膜片相互折叠或膜片包裹支架的模式进行三维培养促软骨细胞的修复与再生。葛阳等[29]将获取的4层完整软骨细胞膜片，依次卷叠于3D打印聚酰胺带孔管状支架，体外培养12周后，可构建出管状软骨样组织。上述研究表明细胞膜片在软骨修复与再生中可以得到很好的应用。

5 展 望

目前细胞膜片的制备方式多种多样，通过各种方式制备而成的细胞膜片保留了大量的细胞外基质，避免了使用单细胞的局限。细胞膜片移植于相应部位可以促进血管生成，促进组织的修复与再生。细胞膜片通过折叠、形成复层细胞膜片等方式，广泛应用于骨、软骨的修复与再生，并取得良好的效果。然而，细胞膜片具有易碎性，可操作性能较低，移植于相应部位无法形成三维空间结构以及初期的生物力学性能较差等问题，需要更多方法去解决。