脂肪干细胞在骨组织工程中的研究进展*

赖文涛 张晓璐 赵志军* 张春阳

骨缺损是人类最常见的创伤之一，常由创伤、肿瘤切除、重建手术、先天性畸形、感染和手术引起。通常，骨缺损可以根据其位置分为不同的亚区：长骨、脊柱、颌面部和颅骨。一般而言，骨组织愈合属于完全再生，然而，在复杂的情况下，如超过临界大小的骨缺损，或是骨周围组织严重损伤等，可能导致愈合延迟甚至不愈合。糖尿病、遗传因素、吸烟或酗酒等不良生活方式也会增加延迟愈合和不愈合的风险。在某些营养不良的患者中，其愈合过程能够导致新骨的祖细胞数量不足，也会导致自然愈合过程失败[1]。骨缺损往往会为患者带来生活、经济等多方面的负担，甚至引起不同程度的残疾。目前，临床上对于骨缺损的主要治疗手段包括：自然愈合、骨植入、骨组织工程等。然而对于缺损严重的骨损伤，自然愈合基本难以实现，骨植入可能导致免疫排斥、供体部位功能障碍或是产生伦理问题等而无法广泛应用于临床。因此，骨组织工程可成为治疗骨缺损的新方向，包括使用干细胞、支架材料、生物活性因子来改善或取代生物功能[2]。本文将从脂肪干细胞的特点及诱导其成骨分化的因素等方面来进行综述，以期为今后临床治疗骨缺损提供新的思路。

1 脂肪干细胞的特点及应用

近年来，脂肪干细胞在参与修复骨缺损疾病中得到广泛研究。骨髓间充质干细胞具有较高的成骨分化潜能，在骨组织工程中应用最为广泛，然而这种采集方式创伤大、容易增加感染风险且会造成严重的疼痛，即使如此，也只能采取少量的干细胞，因此限制了其在临床的应用[3]。相比之下，脂肪干细胞同样也具有多分化潜能，还具有抗缺氧能力强、来源丰富、易于分离、免疫原性低等特点。不仅如此，从脂肪组织中获取干细胞的数量至少是同等骨髓中可获取的500倍[4]。

现如今，脂肪干细胞在骨组织工程中的应用已经较为广泛。Caetano等[5]采用脂肪干细胞与聚己内酯支架材料组成“支架-干细胞复合体”，在大鼠中建立颅骨缺损模型，并用该“支架-干细胞复合体”以及去细胞的支架来治疗大鼠颅骨临界大小缺损，发现采用“支架-干细胞复合体”比去细胞支架效果更好，骨再生更为明显，证实了脂肪干细胞在体内可向骨组织分化，对修复骨组织缺损有积极影响。陈立峰等[6]采用了一种新型支架用于骨移植的表面修饰，该支架以生物素掺杂的聚吡咯钛为骨架，并结合间充质干细胞的外泌体来提高其体内外的生物功能，结果表明在体外实验中采用该方法，超声冲击30 s 后，锚定在聚吡咯钛表面的脂肪干细胞的数量比纯钛高185倍，并能在4℃环境下稳定在聚吡咯钛表面14 d，且在体外对成骨细胞的相容性和骨诱导能力增强，促进脂肪干细胞及骨组织的快速生长以修复骨缺损。在体内实验中，该支架也未表现出免疫排斥、炎症等现象，并能较好地修复大鼠颅骨缺损。

2 脂肪干细胞的获取及鉴定

2.1 脂肪组织的获取

由于脂肪组织的解剖位置和皮下脂肪组织的丰富存在，脂肪干细胞拥有易于获取及侵入性较小的获取技术的优势。为了避免全身麻醉可能带来的风险，只需要局麻的抽脂手术可以获得少量的脂肪组织（100 ～200 mL），即使是这样，仍然比从骨髓获取的组织要多。

2.2 从脂肪组织中提取脂肪干细胞

从脂肪组织中分离干细胞的最初方法是Rodbell 在20世纪60 年代开创的[7]，通过切割大鼠脂肪垫，洗涤以去除杂质细胞，用胶原酶处理组织碎片并离心消化，最后将分离所得的细胞置于塑料培养皿中使其贴壁生长，以获取丰富的细胞。通过对离心速度的控制，也可以进一步提高脂肪干细胞的回收率，1 200g被认为是最佳的离心速度[8]。

2.3 脂肪干细胞的鉴定

由于在逐步离心和消化的分离过程中，只能得到SVF，且该成分中含有几种细胞类型，因此需要进一步鉴定脂肪干细胞。在早期的研究中，脂肪干细胞具有分化成脂肪、骨组织和软骨组织的能力。如今，使用流式细胞术可以通过其表面标志物进行进一步的鉴别和分类，这是从细胞混合物中获得纯细胞群的较好方法。Zuk等[9]通过流式细胞术分析对脂肪干细胞进行了鉴别，并与骨髓间充质干细胞进行了比较。发现两种细胞均表达了CD13、CD29、CD44、CD71、CD90、CD105/SH2 和SH3，这些标志物与SH2 被共同认为是间充质干细胞的特异性标记物。除此之外，脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞均表达了一种骨髓多系祖细胞的特异性标记物STRO-1。然而，在两种细胞群体中都没有观察到造血谱系标记物CD31、CD34和CD45的表达，也没有CD14、CD16、CD56、CD61、CD62E 和CD104。而标志物也会随传代的过程发生变化，CD11a、CD13、CD45、CD86 和抗原(HLA)-DR 的表达随传代程度表达降低。相反，CD40、CD54 和HLA-ABC 在传代过程中表达增加，CD80的表达先增加然后减少。Schäffler等[10]也定义了脂肪干细胞的阳性和阴性标记物以及特异性表达蛋白，发现脂肪干细胞对CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD59、CD73、CD90、CD105、CD106、CD146、CD166、HLAI、纤维连接蛋白、内粘蛋白、平滑肌细胞特异性肌动蛋白、波形蛋白和胶原蛋 白-I 均呈阳性，而 对CD11b、CD14、CD19、CD31、CD34、CD45、CD79a、CD80、CD117、CD133、CD144、HLA-DR、c-kit、MyD88、STRO-1、Lin 和HLAII 均呈阴性。然而，通过比较来自不同研究人员的数据，很难统一明确的脂肪干细胞标记物，因此到目前为止，脂肪干细胞还没有明确的免疫表型，因为表面标记物在传代过程中确实改变了表达。根据不同研究的结果，可以将选定的表面标记物表达谱作为定义脂肪干细胞的基本先决条件[11]，该谱应该包括间充质干细胞标记，如CD105、CD73 和CD90的阳性表达，以及c-kit、CD14、CD11b、CD34、CD45、CD79a、CD19和HLA-DR的阴性表达。

3 诱导脂肪干细胞向骨组织分化的因素

正常的骨组织由细胞、骨胶纤维及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等组成。骨损伤的修复机制主要有两种：一种为直接修复，即骨折或是骨缺损后直接形成骨痂来愈合；另一种为间接修复，骨痂的形成与膜内成骨、软骨内成骨相结合来进行骨修复，后者在骨愈合中更占优势[12]。但大多数情况下，患者所经受的骨损伤较为严重，如果治疗不及时或是治疗时间过长，可能导致畸形愈合甚至不愈合，因此需要探究如何加速骨修复的过程，而能促使脂肪干细胞成骨分化的因素如下所述。

3.1 骨髓基质细胞的ECM促进脂肪干细胞成骨分化

Byun 等[13]发现骨髓基质细胞产生的ECM 可以在体外扩增过程中增强脂肪干细胞的成骨潜能，通过对比脂肪干细胞分别在骨髓ECM 及培养皿中的培养情况发现：ALP、RUNX2 和OC 的表达增加；体外形成的成骨集落数量增加；体内骨组织形成增加。不仅如此，骨髓细胞外基质，如胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和大分子蛋白多糖等也在促进脂肪干细胞成骨分化中起重要作用。Zhang 等[14]用人间充质干细胞来源的ECM为软骨细胞的体外培养提供组织特异性的微环境，发现不仅软骨细胞的增殖能力增强，还保持了其自身的分化能力，这表明人间充质干细胞衍生的ECM微环境在软骨组织工程及软骨再生中有很强的应用前景。

3.2 支架诱导脂肪干细胞成骨分化

支架在诱导脂肪干细胞的成骨分化中也起重要作用。Soleimanifar 等[15]在比较使用聚己内酯-β-磷酸三钙-胶原支架与普通培养皿中培养的脂肪干细胞时，发现在聚己内酯-β-磷酸三钙-胶原支架上具有较高的成骨分化率，并且明显显示出碱性磷酸酶活性、骨钙素表达和矿化形成。这表明脱细胞支架为脂肪干细胞的成骨分化提供了必要的结构和机械环境，诱导其增殖分化及骨基质成分包括胶原蛋白和骨桥蛋白的增加。Liao 等[16]设计了一种热凝水凝胶支架载体，用于包裹兔脂肪干细胞，并在其中加入双相磷酸钙陶瓷微粒作为矿化骨基质，再用富血小板血浆加强骨诱导，与单纯使用水凝胶相比，脂肪干细胞的增殖率及碱性磷酸酶活性增加，细胞外基质钙沉积和矿化程度增强，成骨相关基因的表达也上调，在体内实验中，将其植入兔颅骨缺损模型中，通过CT 扫描、组织学和免疫组织化学分析，成功证实了缺损部位新骨形成，表明热凝复合水凝胶能促进脂肪干细胞在骨组织工程中成骨作用。Romero等[17]通过与对照组比较发现，转染了编码FGF2蛋白的聚乙烯亚胺纳米复合物的脂肪干细胞可导致FGF2的高表达，同时支架内增殖细胞的数量要明显高于对照组，这表明编码了FGF2蛋白的聚乙烯亚胺纳米复合物可能对于脂肪干细胞而言具有较强的诱导能力，在骨再生及骨修复方面具备应用潜力。

3.3 机械、电、磁力促进脂肪干细胞成骨分化

除了生化刺激外，物理刺激对脂肪干细胞的成骨细胞分化过程也是必不可少的。这些刺激包括机械、电和磁力。机械力，如循环拉伸或拉伸，压缩应变和流体剪切应力参与保存骨量及骨发育[18]。机械力被细胞转化为机械传导，然后整合成细胞反应，从而增加骨形成，抑制骨吸收。Morcos等[19]的研究表明，机械刺激是骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞成骨分化的基本生物学因素，是间充质干细胞成骨分化的调节因素。在机械刺激中，环状应变通过典型及非典型的Wnt通路和palladin蛋白的上调来增加脂肪干细胞的成骨分化，流体剪切应力通过增加亚精胺/精胺-N1-乙酰转移酶、Cox-2的过表达、ERK1/2的激活和整合素α5β1的转录来促进脂肪干细胞的成骨，除此之外，流体剪切应力还可通过上调Runx2、ALP、骨钙素和骨桥蛋白的表达来诱导脂肪干细胞成骨。而电刺激则与细胞内钙离子增加有关，通过增加ALP、Runx2和I型胶原的表达，发现2 ～123 Hz之间的直流电磁场和交流电磁场能增加脂肪干细胞的成骨能力，并且钙可激活蛋白激酶ERK1/2、重塑肌动蛋白并诱导脂肪干细胞成骨分化[18]。

4 信号通路对于脂肪干细胞成骨分化的影响

诱导脂肪干细胞进行成骨分化的过程中，许多信号通路在其中发挥了至关重要的作用，其中骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）、Wnt 信号、Notch信号被认为是调节脂肪干细胞成骨分化潜能的主要信号通路[20]。

4.1 BMPs调节脂肪干细胞成骨分化的作用

在多种细胞因子和激素中，BMPs 是促进脂肪干细胞成骨分化的最有力的诱导剂之一。BMPs通过Smad依赖和非Smad 依赖途径发挥作用。在Smad 通路中，BMPs 通过磷酸化Smad1/5/8 与受体结合并激活受体，并与Smad4 形成复合物，转运至细胞核，从而诱导BMPs 靶基因的表达[21]。在BMPs 的16 个亚型中，BMP2、4、6、7、9 被认为是最具骨诱导性的[22]。Li 等[23]使用血管内皮生长因子（VEGF）与BMP6 联合培养脂肪干细胞，发现VEGF 和BMP6联合作用增强了COL1A2的表达，上调了p38丝裂原活化激酶（P38 MAPK），抑制蛋白激酶B（PKB）的激活，从而抑制osterix、dlx 5 和p38 的表达，而这三种基因对于脂肪干细胞成骨分化具有抑制作用，Kim等将编码了VEGF的慢病毒转染脂肪干细胞，获得可分泌VEGF的脂肪干细胞（VEGF-ADSCs），然后通过将白磷钙石（whitlockite，WH）负载到明胶/肝素冷冻材料中，制备成复合物WH-C，发现VEGF-ADSCs分泌的VEGF比脂肪干细胞多10倍，且随着细胞的生长，VEGF 的分泌增加。不仅如此，WH 的加入也提供了一个由WH 分泌的离子矿化环境。在WH-C 上种植VEGF-ADSCs 时，由于VEGF 与肝素的特异性亲和力，可观察到VEGF 的持续释放。最后，通过观察碱性磷酸酶和实时聚合酶链反应证实了VEGF-ADSCs和WH对成骨的协同作用，体内试验中将VEGF-ADSCs与WH-C植入小鼠颅骨缺损模型，可以观察到骨形成、骨发育的增强[24]。增强骨诱导性和血管重建的能力也可以带来叠加的效应，正如增强祖细胞的趋化性或增殖一样，VEGF 与BMP2 联合应用是促进骨形成的最大潜力，这可能是由于前者促进血管生成和增强BMP2介导的骨诱导性的能力。以上都表明，VEGF和BMP信号通路之间的相互作用促进了脂肪干细胞的成骨分化。BMP2 只有在其他活性成骨介质的存在下，才能引起脂肪干细胞的成骨，如抗坏血酸、β甘油磷酸盐、转化生长因子β1 等[25]。Lu 等[26]表明在加入BMP2 的情况下，在新型玻璃纳米粒子支架上培养的脂肪干细胞中Runx2、胶原IA、ALP 和骨桥蛋白基因的表达显著增强，提高了脂肪干细胞修复骨缺损的能力。

4.2 Wnt信号诱导脂肪干细胞成骨分化的作用

Wnt 蛋白是由19 个哺乳动物分泌的糖蛋白组成的家族，参与胚胎发育、组织诱导、干细胞增殖和分化等。Wnt 通过β-catenin 依赖和非β-catenin 依赖途径诱导成骨。在β-catenin 无关的信号转导中，Wnt5A 和Wnt10B 通过抑制脂肪生成促进成骨细胞分化[27]。Wnt5A 的β-catenin 无关信号和ROR2的高表达是脂肪干细胞成骨分化的主要因素。Santos 等[28]使用Wnt5A 与脂肪干细胞共同培育1 周，并对细胞进行总RNA 提取、DNA 含量和碱性磷酸酶（ALP）活性测定，结果表明外源性Wnt5A 可通过增加ALP、Runx2和骨钙素的基因表达来刺激脂肪干细胞的成骨分化，这不仅说明Wnt5A作为脂肪干细胞成骨分化刺激因子的重要性，也表明肌动蛋白细胞骨架的变化是Wnt5A诱导脂肪干细胞成骨分化的决定因素。

4.3 Notch信号调节脂肪干细胞成骨分化的作用

Notch信号是间充质干细胞增殖和成骨分化所必需的。在哺乳动物中，Notch信号上有5个配体（Delta1/3/4和Jag‐ged1/2）和4 个受体（Notch1/2/3/4）。Notch 受体包括细胞外结构域（NECD）、细胞内结构域（NICD）和跨膜受体（TM）。Notch信号通路被认为是平衡骨原细胞增殖和分化的保护性发育机制。Lough 等[29]从脂肪组织中分离出脂肪干细胞，并检测其对Notch 信号通路的反应能力，通过激活或是抑制Notch 信号来观察细胞增殖、活力、细胞外基质沉积和成骨能力，发现Notch 抑制后，细胞增殖、成骨诱导和骨形成能力降低，但在NICD介导的慢病毒转导后，在分子水平和细胞功能水平上均能恢复成骨潜能。这表明利用内源性Notch 信号可调节脂肪干细胞的增殖、分化和成骨。虽然Notch 抑制降低了ADSC 的增殖，下调了骨诱导，但靶向基因治疗和下游NICD 肽的传递恢复了成骨分化的潜能，提示脂肪干细胞在骨再生中具有实际的临床应用价值。

4.4 Hedgehog信号在诱导脂肪干细胞成骨分化中的作用

Hedgehog 信号通路在骨骼发育中同样具有重要作用。在Hedgehog 蛋白（HH）中，Indian Hedgehog（Ihh）对软骨内骨化具有重要意义。在软骨内骨中，Ihh控制成骨细胞的分化，它通过诱导肥大前软骨细胞分化为成骨细胞前体，从而形成骨小梁[30]。James等[31]通过对比两种促成骨因子Hedgehog和Nell-1蛋白对于脂肪干细胞成骨分化能力的影响，发现Hedgehog和Nell-1蛋白均能显著促进脂肪干细胞成骨分化，减少脂肪分化，并且显著增加碱性磷酸酶及成骨基因的表达，这表明Hedgehog和Nell-1蛋白对于脂肪干细胞的促成骨及抗脂肪分化存在加性效应，这可能是诱导间充质干细胞成骨分化的另一种可行的方法。

5 小结

综上所述，脂肪干细胞具有来源丰富、易于分离、免疫原性低等特点。同时脂肪干细胞在适宜的刺激因素下可以进行成骨分化，从而修复骨缺损，但由于脂肪干细胞目前缺乏一个统一高效的培养方法，并且脂肪干细胞等其他干细胞所产生的生长因子、细胞因子、免疫抑制因子和其他生物活性分子可能对肿瘤转移及生长存在一定支持作用，所以仍存在较大挑战，不过随着脂肪干细胞的鉴定、分离、培养以及定向诱导其分化的方法不断发展，其将被广泛应用于骨组织工程，以修复不同程度的骨缺损，改善患者预后。