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力学性能可控的甲基丙烯酸化明胶(GelMA)人工软骨性能及软骨/骨表界面结合研究

2022-10-20申逸志刘芳左丰源余丹邵溢纯周鑫殷义霞

生物骨科材料与临床研究 2022年5期
关键词:明胶孔径软骨

申逸志 刘芳 左丰源 余丹 邵溢纯 周鑫 殷义霞*

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是导致软骨损伤的常见疾病,随着人口老龄化的趋势不断加剧,骨关节炎患者日益增多,目前全球约有2.5 亿人罹患骨关节炎,60 岁以后,大约9.6%的男性和18.0%的女性患有骨关节炎,给患者家庭及社会带来了沉重的压力与负担[1-2]。同时,随着运动性损伤的不断增多,有关软骨损伤疾病的发生率也日渐增高[3]。软骨由于缺乏血管神经营养,一旦损伤很难自我修复[4]。目前,临床上常用的对软骨损伤的治疗方法,如物理疗法、药物疗法、关节镜下清理术、骨软骨移植、微骨折等治疗措施多为对症治疗或替代治疗,且因透明软骨无法再生而难以获得长期稳定的治疗效果[5-6]。近年来,随着组织工程学的发展,利用组织工程支架促进骨软骨再生修复的研究日益受到重视[7-8]。但因为力学性能不匹配等多种原因,软骨/骨表界面结合不牢固,极大地影响了软骨损伤后的治疗效果[9]。

本研究致力于研究组织工程软骨支架甲基丙烯酸化明胶GelMA水凝胶材料,以获得一种能够承载诱导软骨再生细胞(或因子)的支架,将其黏附于缺损软骨处,达到促进软骨再生的目的,为日后组织工程软骨支架的进一步研发提供科学依据,为临床上运用组织工程软骨水凝胶支架实现软骨再生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂及仪器

明胶(Gelatin,美国Sigma-Aldrich 公司)、甲基丙烯酸酐(Methacrylic anhydride,美国Sigma-Aldrich 公司)、磷酸盐缓冲溶液(PBS,美国Hyclone 公司)、光引发剂Irgacure2959(上海迈瑞尔化学技术有限公司)、CCK-8 试剂盒(广州赛国生物科技有限公司)、活/死细胞染色试剂盒(上海联迈生物工程有限公司)、TCP人工仿生骨(武汉华威生物材料工程开发公司)、电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)、恒温磁力搅拌器(DF-101S型,巩义市予华仪器有限公司)、倒置显微镜(上海光学仪器厂)、移液枪(上海大龙设备有限公司)、紫外光源(GHS-LFLG365,深圳光华士科技有限公司)、三维光学显微镜(KH-1000,日本HIROX 公司)、美特斯力学性能试验机(5967,美国英斯特朗公司)、KQ2200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)的合成与GelMA水凝胶的制备

依据Van Den Bulcke 等[10]提出的方法,采用甲基丙烯酸化在明胶上引入双键制得GelMA。取适量冻干后的海绵状GelMA前体,溶解在含有1%(w/v)光引发剂的PBS中,配置成10%(w/v)的GelMA溶液,用移液枪转移至直径为10 mm、高为3 mm的圆柱状模具中,分别于1、2、3 min紫外光照(UV)下光交联后制备GelMA水凝胶样品[11](见图1)。

图1 人工软骨材料制备及实验示意图

1.3 GelMA水凝胶的力学性能分析

按照1.2步骤制得的水凝胶样品,使用美特斯力学性能试验机进行拉伸性能测试,在室温下以0.01 N/s 的速度对样品进行测试。

1.4 扫描电子显微镜(SEM)表征

按照1.2步骤制得的水凝胶样品,冻干后,对水凝胶样品喷金,用扫描电子显微镜(SEM)观察其表面形貌。运用Image J软件对其孔径大小和孔隙率进行分析。

1.5 水凝胶的溶胀性和降解率分析

按照1.2步骤制得不同紫外光照时间(1、2、3、4、5 min)光交联下直径为10 mm、高为3 mm 的圆柱状水凝胶样品,分别测量冻干后的GelMA 水凝胶的干重,记为Wd。将冻干的样品分别浸泡在37℃的PBS 中,分别在2、4、6、8、10、12 h 时取出水凝胶,称重记为Ws,计算溶胀率S。另外将冻干后的样品浸泡在37℃降解酶溶液(20 U/mL)中,于特定时间取出后冷冻干燥,称重记为Wr,计算降解率C。每组测定3个平行样本,取平均值。

溶胀率(S)=(Ws-Wd)/Wd×100%

降解率(C)=(Wd-Wr)/Wd×100%

1.6 GelMA水凝胶的黏附性能

将制备而成的直径为10 mm,高为1 mm,UV 1 min,10%(w/v)的圆柱状GelMA 水凝胶黏附于TCP 人工仿生骨上,定性评估其黏附性能。

使用KQ2200DE型数控超声波清洗器分别对直径10 mm,高为1 mm和0.1 mm的两组黏附于TCP人工仿生骨表面的水凝胶样品进行超声分散处理,将样本浸泡于生理盐水中,时间60 min、功率99%、温度控制在35 ~40℃,待其自然干燥后,用三维立体光学显微镜及扫描电镜观察其表界面结合情况。

分别取120 μL 10%GelMA 溶液采取滴加/吸附的方式到d=10 mm,h=5 mm 的立方体仿生骨材料上,UV 1 min,对其进行超声分散处理,室温干燥24 h后,使用刀片将其从中间切开,用游标卡尺分别测得两种操作方式下GelMA溶液的浸润深度;喷金后,用SEM观察切面结合的表面形貌。每组3个重复样本。

1.7 CCK-8细胞增殖实验

骨髓间充质干细胞分别接种至培养基(对照组)与UV 1 min 样品中(实验组)培养1、3、5、7 d 后,加入CCK-8 试剂与培养基以1∶9 比例配置的工作液0.5 mL,37℃下孵育2 h,取100 μL移入96孔板中,在450 nm测定吸光度(A值)。每组5个平行样本。然后根据如下公式计算细胞的相对增殖率(relative proliferation rate,RGR):

相对增殖率(RGR)=(A/A0)×100%

其中,A是实验组吸光度,A0是对照组吸光度。

1.8 Live/Dead染色观察

选用24孔板,将密度为1.0×104cells/mL骨髓间充质干细胞细胞悬液,每孔加入200 μL。置于37℃、5%CO2孵箱中培养24 h 后,弃去原培养基,用PBS 清洗3 次后分别加入培养基(对照组)和10%GelMA(实验组),放置孵箱内分别培养1、3 d,取出进行Live/Dead染色。测试前分别事先配好活/死细胞染液,先用活细胞染液进行染色,培养20 min后,再用死细胞染液进行染色,培养5 min后,即可取出拍照。利用荧光显微镜进行观察,拍照记录活/死细胞分布。

1.9 统计学方法

应用Graph Prism 软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示,两组间比较用Student'st检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GelMA水凝胶的力学性能

GelMA 水凝胶的拉伸性能如图2 所示。可以看出,随着UV的延长,材料的弹性模量变大,拉伸性能变强。

图2 A.1 min UV GelMA水凝胶的拉伸模量;B.2 min UV GelMA水凝胶的拉伸模量;C.3 min UV GelMA水凝胶的拉伸模量

2.2 扫描电子显微镜(SEM)表征

不同UV 水凝胶样品冻干后的表面形貌SEM 图如图3A-C所示。根据此SEM图,分别计算孔径大小和孔隙率,如图3D、3E 所示。UV 1 min 样品平均孔径为(110.25±6.51)μm,孔隙率为(45.24±2.78)%;UV 2 min 样品平均孔径为(80.42±6.28) μm,孔隙率为(37.79±2.63)%。UV 1 min样品平均孔径大于UV 2 min样品平均孔径,差异有统计学意义(P<0.05)。UV 3 min 样品平均孔径为(75.74±5.59)μm,孔隙率为(34.96±2.82)%,UV 1 min样品平均孔径大于UV 3 min 样品平均孔径(P<0.05),UV 2 min 样品平均孔径小于UV 3 min 样品平均孔径(P>0.05)。可以看出,随着紫外光照时间的增加,GelMA水凝胶的孔隙率相对降低,孔的数目有减小的趋势。

图3 A.1 min UV GelMA水凝胶的截面SEM图;B.2 min UV GelMA水凝胶的截面SEM图;C.3 min UV GelMA水凝胶的截面SEM图;D.三种UV下GelMA水凝胶的孔径大小;E.三种UV下GelMA水凝胶的孔隙率

2.3 GelMA水凝胶的溶胀性和降解率

GelMA水凝胶的溶胀性能测试结果如图4A、4B所示。可以看出,水凝胶在2 h 后的平衡溶胀比基本稳定,其中UV为1 min组别的水凝胶样品在12 h时的平衡溶胀比数值最大为(148.43±3.84)%,与其他组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。随着光照时间的增加,GelMA 水凝胶的溶胀速率和平衡溶胀比都会减小,说明其溶胀能力减小。

GelMA 水凝胶的降解性能结果如图4C 所示。结果显示,水凝胶前7 d的降解速率最快,之后趋于平缓,其中UV为1 min组别的水凝胶样品在28 d失重率(17.40±2.38)wt%。同时,随着光照时间的增长,最终水凝胶的失重率越高,最高达(42.8±1.83)wt%。

图4 A.各组GelMA水凝胶的平衡溶胀比随时间变化曲线;B.12 h时各组GelMA水凝胶的平衡溶胀比;C.各组GelMA水凝胶的失重率随时间变化曲线

2.4 GelMA水凝胶软骨材料与骨修复材料的表界面结合

定性观察GelMA水凝胶黏附性能如图5所示。可以看出,制备的GelMA水凝胶可以较好地黏附于TCP人工仿生骨、橡胶、人皮肤表面,而无需使用其他黏合剂。

超声分散处理后GelMA水凝胶三维立体光学显微镜观察结果如图6 所示,SEM 结果如图7 所示。通过三维立体显微镜观察发现,超声分散后,GelMA水凝胶仍黏附于仿生骨表面,未见明显脱落。SEM观察下,GelMA水凝胶形成膜样结构与TCP人工仿生骨紧密黏附在一起,超声分散对TCP 人工仿生骨的结构不会有明显的破坏,不会导致GelMA水凝胶从TCP人工仿生骨表面脱落。

图6 超声分散前后,空白对照组、高为1 mm组、高为0.1 mm组各组三维立体光学显微镜观察示意图

图7 超声分散前后,空白对照组、高为1 mm组、高为0.1 mm组各组TCP人工仿生骨与GelMA结合面的SEM图

采取滴加方式使GelMA 与仿生骨结合的切面SEM 结果如图8A、8B 所示;采用吸附方式使GelMA 与仿生骨结合的切面SEM结果如图8C、8D所示。GelMA浸润仿生骨的深度界限大致清晰,两种试验方式下所观察到的浸润情况无明显的差异性,SEM下所观察到填充满仿生骨孔样结构的微小颗粒状物为切开操作过程中,仿生骨磨损所掉落下来的白色粉末状物质。

图8 A.滴加方式下GelMA与TCP人工仿生骨结合表界面切面SEM观察图(×30);B.滴加方式下GelMA与TCP人工仿生骨结合表界面切面SEM观察图(×100);C.吸附方式下GelMA与TCP人工仿生骨结合表界面切面SEM观察图(×30);D.吸附方式下GelMA与TCP人工仿生骨结合表界面切面SEM观察图(×100)

滴加方式用游标卡尺测得大致浸润深度(2.06±0.08)mm;吸附方式用游标卡尺测得大致浸润深度(2.03±0.09)mm。两种试验方式的平均浸润深度的相近,无统计学差异性(P>0.05)。可以认为,滴加或吸附的试验方式对GelMA与仿生骨的结合无影响。

2.5 样本内细胞增殖评估

CCK-8实验结果如图9所示,UV 1 min GelMA水凝胶浸提液的骨髓间充质干细胞在1、3、5和7 d的相对增殖率分别为95.37%、95.98%、98.05%和98.77%。

图9 培养不同时间点两组样本内的细胞增殖

2.6 细胞Live/Dead染色结果

共培养1 d后Live/Dead染色结果如图10所示。对照组可见红色细胞(死细胞)数量明显多于实验组,细胞形态正常、包膜完整。10%GelMA对骨髓间充质干细胞无明显抑制作用。

图10 骨髓间充质干细胞在10%GelMA培养1d时的Live/Dead染色(绿色:活细胞;红色:死细胞)

3 讨论

骨关节炎(OA)和创伤带来的软骨损伤都面临着软骨缺损无法再生修复的问题,只有软骨再生才是治疗上述疾病的具有确切疗效的方法[12-13]。众多学者从组织工程学入手,已获得了一定的研究成果与结论。但迄今为止,尚未发现性能理想,并运用于临床的软骨支架。

明胶是胶原蛋白部分水解而来的产物,是一种天然的高分子材料,具有良好的生物相容性、生物降解性和温敏性,但纯明胶水凝胶存在着热稳定性差与力学稳定性差等问题[14-15]。故将其采用光交联的方式与甲基丙烯酸酐结合,能够提高其理化性能,使其更适合应用于软骨支架[16]。明胶与官能团结合后可通过酶促反应或光反应共价交联,相较于酶促交联,光交联更易于控制,反应条件较温和,可以影响预期强度,降解率和相容性[17-18]。同时,光交联的操作简便且对环境友好,可将光敏性的材料直接在病损位置原位交联,通过改变光交联反应条件,可以调控GelMA的多孔结构,使其孔径大小和密度适合于凝胶内的营养物质、氧气和代谢产物的输送[19]。路冬冬等[20]使用紫外光交联制备出负载BMSCs 的GelMA 水凝胶支架能够产生较多的骨基质,有效重现软骨下骨的骨小梁结构,促进软骨下骨的修复,也能够有效形成软骨样组织来填充软骨缺损。

本实验通过紫外光交联的方法,优化配比,对材料的力学性能进行了可控性探索,实验显示:紫外光照1 min交联的10%(w/v)GelMA 水凝胶其孔隙大小(110.25±6.51)μm,孔隙率(45.24±2.78)%;12 h时的平衡溶胀比达(148.43±3.84)%;28 d 失重率(17.40±2.38)wt%。其吸水速率和平衡溶胀比最佳,降解速快,拉伸性能与天然软骨结构类似,具有良好的生物相容性,与骨修复材料力学匹配。与其他机械性能较差、降解速率过快、稳定性不足天然高分子材料(如胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖),以及难降解、细胞难黏附的人工材料(如聚乙二醇等)相比,本实验所选择的GelMA 水凝胶具有良好的力学性能,合适的孔隙大小及孔隙率,适宜的平衡溶胀比及生物降解率。Costantini 等[21]运用3D 打印技术制造了类细胞外基质的GelMA 水凝胶支架负载BMSCs,发现BMSCs 的成骨、成软骨分化能力增强。与文献的结果类似,本研究发现该水凝胶能促骨髓间充质干细胞增殖,且活/死染色实验显示,GelMA水凝胶中的细胞存活率较高,表明其具有良好的生物相容性。因此,该水凝胶在软骨缺损修复方面有潜在的临床应用价值。

本实验还通过与骨修复材料表界面的研究显示,10%(w/v)GelMA 水凝胶制备的人工软骨材料,经过1 min 紫外交联,与骨修复材料结合牢固,具有较好的表界面稳定性能。该材料运用于软骨损伤患者时,将能够承受患者日常活动所带来的机械冲击力,构建利于关节软骨物质运输的三维立体微环境,并在软骨/骨相关修复过程中与骨组织附着良好,能够促进软骨修复,为软骨/骨修复中的界面和促进修复等问题提供了新方法和新思路。

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