基于电子鼻和顶空气质联用技术的不同产地北柴胡气味差异分析△

轩菲洋，姜丹，申小营，周娜，任广喜，刘春生

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狭叶柴胡B.scorzonerifoliumWilld.的干燥根。按性状不同，分别习称北柴胡和南柴胡。柴胡气辛，具有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气等功效[1]。柴胡作为传统解表药物，其挥发油类化合物是其发挥解热、抗炎作用的主要成分[2]。前人对柴胡挥发油的提取方法及不同种柴胡的挥发油差异情况进行了分析[3-4]，但是对于不同产地北柴胡气味差异和挥发性成分综合分析，目前尚未见报道。

电子鼻是模拟人类嗅觉系统而研制的一种气味检测仪器，利用各个传感器对复杂气体响应不同的特点，快速对多种气味进行识别，客观分析与评定药材气味特征，以气味特征为指标快速鉴别和评价药材，因此在中药材质量评价领域得到了大量应用[5-8]。顶空气相色谱-质谱法（HS-GC-MS）可对多组分混合物进行快速定性及单组分相对定量的分析，GC-MS 目前多应用于药材质量等级评价，通过建立质量评价模型分析微量挥发性组分，从而实现对不同品质药材挥发性物质基础的分析[9]。电子鼻和HSGC-MS 分析，将中药材的外在气味性状和挥发性物质的组成分析相结合，能快速鉴定不同气味差异的药材，并解析相应气味产生的物质基础[10]。本研究采用电子鼻和GC-MS 联用的方式对来自3 个地区9个市共18 批北柴胡药材综合分析，从而对北柴胡产生的气味进行量化分析，并对气味产生的具体化学成分做进一步解析，以期为柴胡气味产生的物质基础研究提供参考。

1 材料

1.1 药材

柴胡药材分别采自山西省、黑龙江省和内蒙古自治区3个地区9个市，共18份样品，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根，样品信息见表1。

表1 柴胡样品采样信息

1.2 仪器

α-Fox3000 型气味指纹分析仪（法国Alpha M.O.S公司），由自动顶空进样仪HS100和主机两部分组成，主机中安装有12 根MOS 传感器。12 根传感器敏感成分见表2。

表2 电子鼻传感器敏感成分

7697A HS-7890B GC-5977A MS 型顶空进样-气相色谱-质谱仪（美国Agilent 公司）；BSA124S 型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；FW200 型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）。

2 方法

2.1 不同产地柴胡样品挥发性成分的电子鼻测定

精密称取药材样品粉末（过四号筛）0.20 g 装入10 mL 顶空瓶中密封；孵化箱温度60 ℃；孵化时间360 s；样品振荡速度250 r·min-1；以纯净空气为载气，载气流速为150 mL·min-1；注射体积2000 μL；注射速度为2000 μL·s-1，注射针温度为70 ℃；数据采集时间为120 s，数据采集延迟时间600 s，每个样品重复5次[11]。

2.2 不同产地柴胡样品挥发性成分的HS-GC-MS测定

样品制备：将柴胡用高速万能粉碎机粉碎，过四号筛。称取柴胡粉末1 g 迅速装入20 mL 顶空进样瓶，加盖密封，待测。色谱条件：HP-5MS 毛细管色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm），样口温度130 ℃，载气为高纯氦气（纯度＞99.999%），流速1.0 mL·min-1；柱流量控制模式为恒流；升温程序：初始柱温40 ℃，以1.5 ℃·min-1升至70 ℃，以10 ℃·min-1升至210 ℃。后运行温度230 ℃，5 min。质谱条件：离子源为电子轰击离子源（EI），碰撞能量为70 eV，全离子扫描模式，离子源温度230 ℃，四极杆温度为150 ℃，接口温度130 ℃；溶剂延迟3 min。顶空条件：孵育温度120 ℃，定量环/阀温度130 ℃，传输线温度130 ℃，GC 循环时间55 min，孵育时间40 min，进样量1000 μL[12]。

2.3 数据处理

每个样品电子鼻各传感器5 次测定的均值为特征值，进行主成分分析（PCA）及线性判别分析（LDA）。HS-GC-MS 检测时化合物的鉴定采用NIST标准质谱图库（https://webbook.nist.gov/chemistry/）检索（匹配度＞90%）和参考相关文献。利用峰面积归一化法进行定量。利用SIMCA 14.0软件对共有成分做偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）筛选变量投影重要性（VIP）值＞1 的潜在差异成分，对挑选出的不同产地差异成分及特有成分分别进行PCA；17个化合物的相对质量分数和12根传感器特征值作PLS-DA。用Unscrambler 10.4 绘制双标图呈现PCA和PLS-DA 两向数据表所得出的结果，分析本研究中传感器-挥发性化合物两向数据可以对试验结果的相关性进行直观比较。

3 结果与分析

3.1 不同产地柴胡电子鼻分析

3.1.1 电子鼻不同传感器对柴胡气味的响应值 分析JB1样品的电子鼻12个传感器的检测响应图（图1）。横坐标表示时间，纵坐标响应强度对应各传感器的相对电阻变化率[（R0-R）/R0]。R0为初始的电阻值，R为随时间变化的响应电阻值。每条曲线代表一个传感器在120 s内的响应变化。样品采集后，各传感器响应值随着挥发性气体在传感器上富集，传感器响应值迅速增大，各个传感器响应值在不同时间点达到最大后，又逐渐下降趋于平稳。

图1 电子鼻12个传感器对柴胡样品（JB1）的响应曲线

3.1.2 不同产地柴胡样品电子鼻特征气味差异分析 选取数据采集120 s内传感器最大响应值，绘制柴胡样品的电子鼻特征气味的雷达指纹图（图2）。12 根传感器对样品挥发性成分的响应不同，其差异主要体现在S7～S12 6 根传感器上。S7～S12 对甲烷、氟、芳香类、乙醇、氨气、有机胺类较敏感，推测不同产地柴胡气味差异主要表现在烃类、芳香类、胺类等挥发性物质的差异。

图2 18批柴胡样品各电子鼻传感器响应值的雷达图

3.1.3 不同产地柴胡电子鼻监测数据的PCA 对不同产地柴胡的气味采用PCA，由图3 可知，主成分1（PC1）由S7、S11、S8、S12、S10、S9、S1组成，方差贡献率为51.01%，PC2 由S4、S5、S2、S3、S6 组成，方差贡献率为36.84%，PC1 和PC2的累积贡献率达87.85%，说明2 个主成分包含了原始数据的多数信息。还可以看出不同地区之间，山西省和内蒙古自治区的柴胡样本气味更接近，与黑龙江省样本气味差异较大；在山西省内，晋南气味多样性较晋北丰富；在黑龙江省内，采自大庆的样本与采自齐齐哈尔的样本气味差异性较大。利用电子鼻数据的PCA 仍不能将不同产地柴胡进行区分。

图3 不同区域柴胡电子鼻数据的PCA

3.1.4 不同产地柴胡电子鼻监测数据的LDA LDA是模式识别的经典算法，其主要过程是对检测样本赋值，并将分类后的样本信息投射到一维象限中，使得投影后组内方差最小，组间方差最大[13]。本研究中，对电子鼻传感器感应到的挥发性物质的响应信号做进一步处理，通过缩小组内方差，扩大组间方差，更直观反映不同组之间的差异。结果见图4，判别式LD1 和LD2 的方差区分度分别是79.51%和20.42%，总方差区分度达99.93%，可以较好地反映不同样品的气味信息。不同产地样品之间区分明显，晋南和晋北柴胡气味相近但也存在一定差异，黑龙江省柴胡和内蒙古柴胡的气味与山西柴胡有明显差异。因此可以得出，晋北、晋南、内蒙古和黑龙江的柴胡样品电子鼻数据LDA 相较于PCA，区分效果更好。

图4 不同区域柴胡电子鼻响应值的LDA

3.2 不同产地柴胡样品的GC-MS分析

3.2.1 不同区域柴胡样品的GC-MS 分析总体差异分析 采用HS-GC-MS 对采自3 个地区18 个产地的柴胡样品的挥发性成分进行分析，利用Nist 库进行定性分析（匹配度达到90%以上），共鉴别出76 个成分（表3），其中烷烃类6 个、烯烃类15 个、醇类14 个、醛类16 个、酮类7 个、酯类9 个、芳香类7个、胺类及羧酸各1 个。采用面积归一化法，根据不同化合物峰面积计算相对质量分数，对不同区域内的柴胡样品进行了分析，并绘制了堆积图（图5），不同产地柴胡样品之间醛类、醇类、芳香类、胺类等化合物相对质量分数差异明显。

图5 不同区域柴胡各类型挥发性物质分析比较结果

表3 18批柴胡中挥发性成分的相对质量分数

续表3

续表3

3.2.2 不同区域柴胡样品主要差异类型挥发性物质的对比分析 所有柴胡样品的醛类化合物的共有成分有16 种，其中己醛的含量变化在不同产地之间差异较大，其在晋北样品中相对质量分数（78.17%）是黑龙江样品（13.98%）的5 倍。庚醛在内蒙古样品的相对质量分数（10.87%）明显高于晋南（0.34%）、晋北（0.28%）和黑龙江（0.02%）样品，辛醛在内蒙古样品的相对质量分数（0.56%）明显高于晋南（0.09%）、晋北（0.05%）和黑龙江（0）。部分醛类化合物在不同产地柴胡中相对质量分数差异显著，可能为不同产区柴胡气味差异的依据。不同产区柴胡样品芳香类化合物共有成分4 种，其中2-正戊基呋喃在内蒙古样品的相对质量分数（13.79%）明显高于山西和黑龙江（0）；对异丙基甲苯、1-甲基-4-(1-丙烯-1-基)苯、4-甲基苯酚3 种芳香类物质是黑龙江和山西特有的芳香类化合物，其中对异丙基甲苯在黑龙江齐齐哈尔的相对质量分数（65.26%）是山西（11.19%）的6 倍。不同产区柴胡样品的醇类化合物共有成分14 种，其中1-戊醇的相对质量分数在不同产地之间差异较大，晋北（9.84%）是黑龙江（2.00%）的5 倍，且两者均远高于内蒙古（0.04%）样品。不同产区柴胡样品的胺类化合物共有成分是三乙胺，相对质量分数内蒙古样品（9.17%）远高于山西（0.04%）和黑龙江（0）样品。

为了确定哪类挥发性成分在区分不同产地柴胡上起了重要作用，利用SIMCA 14.0软件对不同产地柴胡挥发性成分进行分析，筛选出VIP＞1 的具有显著性差异的成分有11 个。这些成分可以作为区分不同产地柴胡的依据。同时挑选出不同产地的7 个特有成分，将其看作区分不同产地柴胡的关键成分。分别用显著性差异成分和特有成分的相对质量分数作PCA图（图6），在显著性差异成分的PCA图中指向性更明显（图6A），内蒙古柴胡在第一象限，2-正戊基呋喃（C9）、α-蒎烯（C14）、β-蒎烯（C16）、庚醛（C47）、三乙胺（C75）指向该区域；黑龙江柴胡在第四象限，十一烷（C5）、对异丙基甲苯（C7）落在该区域；晋北柴胡落在第二象限，2-正丁基呋喃（C11）、1-戊醇（C42）、己醛（C43）、2-辛酮（C63）指向该区域；晋南柴胡落在二、三象限，位于晋北柴胡和内蒙古柴胡之间，表明上述化合物在区分不同产地柴胡时起着重要作用；而利用不同产地的7个特有性成分进行PCA（图6B）可以看出，在第一象限中既存在晋南柴胡样品，也存在黑龙江柴胡样品；第二象限中既存在晋北产区柴胡样品，也存在黑龙江及内蒙古产区柴胡样品；第三象限中虽然仅为山西省柴胡样品，但晋南样品和晋北样品均存在，说明不能利用7 个特异性成分的PCA 对柴胡样品的产区进行分类。

图6 不同区域柴胡样品化合物的PCA双标

3.3 不同产地柴胡样品气味与化学成分的关联分析

为研究柴胡产生气味的化学成分和电子鼻传感器之间的感应机制，对17 种成分（显著差异成分、特有成分）和12 根传感器的数据做PLS 双标图分析（图7）。由PLS 图和电子鼻载荷图可以发现，S11、S7、S8、S12、S9、S10 强相关，S2、S3、S4、S5、S6 强相关。在PLS 双标图上电子鼻和化合物距离越近，代表其相关性越强。结合显著性差异成分PCA图，山西柴胡C11、C42、C43、C63 主要和传感器S11、S7、S8、S12、S9、S10 相关，内蒙古柴胡C9、C14、C16、C47、C75 主要和传感器S2、S3、S4、S5、S6 相关，黑龙江柴胡C5、C7 主要和传感器S1 相关。结合雷达图，电子鼻响应值差异主要集中在S7～S12 传感器，因此，区分18 批柴胡气味差异的物质基础主要是C11（2-正丁基呋喃）、C42（1-戊醇）、C43（己醛）、C63（2-辛酮）。

图7 18批柴胡样品中17种成分与电子鼻12个传感器相关性的双标图

4 讨论

电子鼻技术是一种敏感性高、选择性强的高效、绿色检测技术。近年来电子鼻技术除了在白酒[14]、茶叶[15]等方面应用较多外，在中药基原[16]、产地[17]、生长年限[7]、采收时间[7]及炮制方式[18]等方面也得到了应用。而来源于伞形科柴胡属的北柴胡中含有多种挥发油类成分，是其具有镇痛、解热、抗炎等功能的物质基础[19]。本研究利用电子鼻对采自山西、黑龙江及内蒙古自治区的柴胡样品气味进行了测定，并通过PCA和LDA两方式进行了分析，发现晋南柴胡在各个象限都有分布，晋北柴胡分布在一、二象限，黑龙江柴胡分布在三、四象限，内蒙古柴胡分布在第二象限，故PCA 并不能很好地区分不同产地的柴胡样品。在PCA 的基础上，对响应信号进行LDA，发现利用LDA 可以将采自不同产地的柴胡样品进行区分。因此，对不同药材利用电子鼻进行分析时，应根据不同药材的情况选择合适的数据分析方法。利用HS-GC-MS 检测不同产地柴胡样品的挥发性成分，共得到76 个成分，主要包括烷烃、烯烃、醇、醛、酮、酯、芳香、胺及羧酸类成分。应用SIMCA 14.0 软件对不同产地挥发性成分进行分析，VIP＞1的成分共有11个，主要存在于芳香、醛、醇、胺、烯烃类等成分中，是区分不同产地柴胡的主要成分，且利用PCA 对不同产地柴胡样品的HSGC-MS数据所得的结果与利用LDA对柴胡电子鼻数据的分析结果一致。雷达图中各批柴胡样品电子鼻响应值差异主要集中在S7～S12 传感器，结合PLS 双标图，区分18 批柴胡气味差异的物质基础主要是己醛、1-戊醇、2-辛酮、2-正丁基呋喃。18 批柴胡中挥发性成分相对质量分数最高的是己醛（13.98%～78.17%）。叶耀辉等[20]GC-MS 分析柴胡不同炮制品的挥发性成分发现己醛是各炮制品共有成分中相对质量分数最高的，己醛可能是柴胡发挥药理效用重要物质基础之一。香气是柴胡的一个重要特征，可以通过进一步实验评估正己醛是否可以作为一个评价柴胡质量的指标性成分。

本研究显示利用电子鼻可以区分不同产地的柴胡样品，并采用HS-GC-MS 对不同产地柴胡样品气味电子鼻响应的物质基础，为以挥发油为主要活性成分的柴胡气味的物质基础与传感器反应之间的机制解析提供了实验依据，同时为电子鼻在柴胡质量评价上的应用提供了基础。