细胞骨架对毫针针刺“足三里”调控穴区温度、电阻和ATP/ADP的影响

张 婷，赖 清，陈 波，王 鼎，吴永强，周 媛，司原成，莫曦雅

(贵州中医药大学 针灸推拿学院，贵州 贵阳 550025)

毫针针刺是针灸防治疾病的常用手段，是医者借助毫针在人体腧穴(或其它特定部位)施以一定的手法操作，从而达到疏通经络、调和气血、扶正祛邪目的的一种中医临床外治方法。腧穴是由已知结构立体构筑所组成的综合体[1]，是针刺作用的初始应答环节，也是针刺信号的信息转换平台，在针刺效应的转换和启动中具有重要作用。实验针灸学研究确认毫针对机体的有效刺激本质是机械刺激[2]。生物医学工程细胞生物力学研究发现力学诱导细胞膜和胞内某些蛋白分子的形变能将机械信号转换成生物化学信号，启动下游细胞信号通路的级联反应[3-4]。课题组近年来研究发现细胞骨架微丝、微管能够在针刺过程中应力发生变化向细胞内传递机械力学信息[5-6]，但是细胞骨架结构受破坏后是否影响正常针刺的效应，目前尚不清楚。因此，本研究选取生物热学特性、电学特性和能量代谢特性三方面，重点探讨细胞骨架中微丝和微管结构完整与否对正常针刺的反应是否有其他影响，为进一步阐释细胞骨架在针刺机理中的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

6～8周龄SPF级SD雄性大鼠48只，体质量(200±20)g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0014。动物饲养于贵州中医药大学动物实验室，室温(22±1)℃，相对湿度(50±5)%，光照12 h明暗交替(明期8：00-20：00)，大鼠自由摄食进水。采用随机数字表法将大鼠分为正常组、干扰微丝组和干扰微管组3组，每大组16只，各组再按窝别、体质量、活跃度因素配对后随机分为非针刺组与针刺组2个小组，每小组8只。所有实验操作均严格遵守中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 主要仪器与试剂

电子天平(WT型，杭州万特衡器公司)；红外体温计(CK-T1503，深圳长坤科技公司)；直流低电阻测试仪(YP2512，深圳永鹏仪器公司)；冻存管(607001，美国NEST)；液氮罐(YDS-20，青岛海尔特种电器公司)；酶标分析仪(Infinite F50，瑞士Tecan)；一次性无菌针灸针(0.30 mm×25 mm，吴江云龙医疗器械公司)。

秋水仙碱(MB1063-S，大连美仑生物技术公司)；细胞松弛素B(D8370-500ml，美国Apexbio)；二甲基亚砜(1121E0323，北京索莱宝科技公司)；水合氯醛(1113A20，北京雷根生物技术公司)；大鼠三磷酸/二磷酸腺苷ELISA试剂盒(ZK-R4622/ZK-R3711，深圳子科生物科技公司)。

1.3 干预方法

大鼠适应性喂养7天后进行干预。各组大鼠称重后，于右侧“足三里”穴周备皮，穴位定位参考《实验针灸学》附录四[7]，定位为：膝关节下外侧，腓骨小头下5 mm。各组大鼠称重备皮后分别用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，麻醉剂量(mL)=大鼠质量(g)×0.3 mL/100 g。

正常针刺组麻醉后消毒右侧“足三里”穴，毫针直刺5 mm，按(60±2)r/min的频率均匀捻针，捻转幅度为180°～360°，捻针5 min，留针10 min，然后再捻针5 min，以此类推，共捻针3次，于第3次捻针完毕后出针，每天1次，共操作3天。正常非针刺组麻醉后与正常针刺组做相同的抓取、固定，不施加其他处理。干扰微丝针刺组麻醉后于右侧“足三里”穴注射细胞松弛素B 300 μg，30 min后参照正常针刺组进行毫针针刺，每天注射和针刺各1次，共操作3天。干扰微丝非针刺组麻醉后于右侧“足三里”穴注射细胞松弛素B 300 μg，每天1次，共操作3天。干扰微管针刺组麻醉后于右侧“足三里”穴注射秋水仙碱250 μg，30 min后参照正常针刺组进行毫针针刺，每天注射和针刺各1次，共操作3天。干扰微管非针刺组麻醉后于右侧“足三里”穴注射秋水仙碱250 μg，每天1次，共操作3天。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 穴区温度值 各针刺组大鼠行末次刺激后，俯卧位固定，(非针刺组将大鼠静置，静置时间与针刺组针刺时间相同)，用红外体温计温度探头置于穴区皮肤上3～5 cm处，每隔10 s记录1次温度值，记录1 min，共记录6次，取平均值为穴区温度值。

1.4.2 穴区电阻值 温度测量后，各组大鼠继续俯卧位固定，以进针点为中心，在直径5 mm范围内用75%酒精进行涂擦，无关电极蘸生理盐水后，固定在右侧后肢足掌中，并将蘸少许生理盐水溶液的探测电极分别置于被测穴位进针点和其上下左右各1.5 mm 处共5个点观测电阻，取平均值为穴区电阻值。

1.4.3 穴区ATP与ADP含量 于第3天检测完温度、电阻后，将大鼠脱颈处死并立即取材。取材方法为：于大鼠右侧后肢进一步备皮、消毒，切开皮肤后，以大鼠针刺点为圆心，直径约5 mm、垂直深度约5 mm的区域内取穴区皮下组织块约200 mg。组织块取下后用生理盐水冲洗，置入冻存管后于液氮中保存备用。ELISA法检测组织块ATP与ADP含量：组织匀浆后取上清液作为检测标本，按照试剂盒说明书稀释为6个浓度梯度，稀释后各孔加样量都为50 μL，设空白孔及样品孔。每孔加入酶标试剂100 μL，空白孔除外，并用封板膜封板后置37 ℃温育60 min。配液洗涤，每孔加满洗涤液，静置60 s后弃去，如此重复洗板5 次。显色，加入底物A和B各50 μL，37 ℃避光显色15 min，每孔加终止液50 μL，450 nm波长依序测量各孔的吸光度值，计算样品含量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 25.0软件进行统计分析，所有数据均以均数加减标准差表示。各组非针刺组与针刺组的组间数据采用配对t检验分析；组别间调节幅度采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠穴区温度值比较

正常组、干扰微丝组、干扰微管组各组在针刺后，穴区局部温度均较非针刺状态降低(P<0.01)；干扰微丝组和干扰微管组较正常组，温度调节幅度也均更大(P<0.01)。见表1。

表1 细胞骨架对正常生理状态下毫针针刺调控穴区温度的影响

2.2 各组大鼠穴区电阻值比较

正常组、干扰微丝组、干扰微管组各组在针刺后，穴区局部电阻均较非针刺状态降低(P<0.01)；干扰微丝组较正常组，电阻调节幅度更大(P<0.01)；干扰微管组较正常组，电阻调节幅度无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 细胞骨架对正常生理状态下毫针针刺调控穴区电阻的影响

2.3 各组大鼠穴区ATP/ADP比值比较

正常组、干扰微丝组在针刺后，穴区ATP/ADP比值较非针刺状态升高(P<0.01)；干扰微管组针刺后，穴区ATP/ADP比值较非针刺状态无统计学差异(P>0.05)；干扰微管组较正常组，穴区ATP/ADP调节幅度偏小(P<0.01)。见表3。

表3 细胞骨架对正常生理状态下毫针针刺调控穴区ATP/ADP特性的影响

3 讨论

细胞骨架是一种位于细胞核及细胞膜内侧面的纤维状蛋白质基质，由微管、中间丝和微丝组成，广泛存在于真核细胞内，在维持细胞形态、承受外力、保持细胞内部结构、参与细胞生命活动等方面起重要作用[8-9]。微管由α、β微管蛋白以二聚体形式头尾相连聚合而成，是细胞骨架的架构主干。微管的功能取决于其连续聚合和解聚的动力学性质，秋水仙碱通过与微管蛋白异二聚体结合，促进了微管的降解进程[10-11]。微丝即肌动蛋白丝，是由肌动蛋白分子螺旋状聚合成的丝状肌动蛋白，集中分布于质膜下，参与维持细胞形状和赋予质膜机械强度。细胞松弛素可阻止微丝快速生长端球状肌动蛋白的添加，从而降低微丝聚合速率，使微丝网格结构破坏[12-13]。中间丝又称作中间纤维，由一个或多个不同的亚单位形成，使细胞具有张力和抗剪切力作用。使用去垢剂、高盐溶液等抽提细胞后，中间纤维仍保持结构的完整性，是最稳定的细胞骨架成分[14]。

针刺能调节穴区温度变化，是针刺调节被刺腧穴热敏特性发生变化的外在表现[15]。有研究选取健康受试者的曲池穴行针刺刺激，发现针刺曲池穴即刻，曲池、温溜、手三里穴的温度下降，肘髎穴温度升高，而在针刺曲池穴10 min后，曲池、肘髎穴温度较针刺前升高，温溜、手三里穴温度低于针刺前水平[16]。这表明针刺对于穴区温度有双向调节作用，且受机体状态、手法、针刺时间、刺激强度等因素影响[17-18]。本研究中所采用的针刺方法对于大鼠“足三里”穴具有明显降温作用，干扰微丝组和干扰微管组针刺后穴区温度均较非针刺状态也降低，且较正常组温度调节幅度更大，说明微丝、微管完整与否对正常针刺的温度调控有干扰作用。

经穴的电学特性是指在生理病理不同机能状态下，人体相关的经穴组或耳穴群电阻、电容、电位甚至电感等的特异性。人体穴位存在电阻抗特性和伏安特性，穴位的电阻是不同组织的电阻之和，具有低电阻、高电位的特性[19]。一般情况下，针刺能进一步降低穴位电阻[20]，而本研究中，干扰微丝组、干扰微管组针刺后穴区电阻值均较非针刺状态降低，干扰微管组较正常组电阻调节幅度无统计学差异，而干扰微丝组较正常组电阻调节幅度更大，说明细胞骨架微丝完整与否对正常针刺的电阻调控有干扰作用。

能量代谢指能量的释放、转移、存储和利用。线粒体是细胞生命活动的控制中心，通过三羧酸循环生产维持细胞正常功能所需的ATP[21]。1分子ATP和1分子AMP可以催化反应生成2分子ADP[22]。ATP与ADP的比值，可以反应能量代谢水平，当ATP生成增多时，ATP/ADP比值升高，ATP水解增多时，则ATP/ADP比值下降。线粒体主要沿微管轨道运动，微丝则协助微管对线粒体进行短距离运输[23]，细胞骨架对线粒体的形态和功能起调节作用[24]。本研究中，正常组针刺促进了穴区ATP/ADP比值的提高，但干扰微管组较正常组穴区ATP/ADP调节幅度减小，说明细胞骨架微管对正常针刺的能量代谢能产生明显影响。

综上，毫针针刺能降低穴区局部温度与电阻，提高穴区局部能量代谢水平，而细胞骨架在毫针针刺调控穴区局部反应的作用中，微丝、微管对正常针刺的降温效应均有影响，微丝对正常针刺的降电阻效应有影响，微管对正常针刺的升高能量代谢水平效应有影响，说明细胞骨架是影响针刺信息传递和调控针刺效应的重要途径。今后，需研究在不同疾病状态下研究细胞骨架对针刺效应的影响是否相同。