乙酰肝素酶和环氧合酶-2在动脉粥样硬化相关疾病中的研究进展*

王诗琪，王蒙琴，韩轩茂，蔺雪峰，张 柱

(包头医学院第一附属医院心内一科，内蒙古包头 014010)

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是临床最常见的心血管疾病，表现为血管内膜的脂质沉积、灶状纤维化乃至纤维斑块的形成，是一种由多种炎症因子共同参与的、复杂的、慢性炎症反应[1]。有研究证实乙酰肝素酶(heparanase,HPSE)和环氧合酶-2(cyclooxyenase-2,COX-2)参与AS斑块的形成，并与病变严重程度相关，且参与了急性冠脉事件全过程。现就HPSE和COX-2在动脉粥样硬化相关疾病发生发展过程中的机制及其在冠心病病情判断、预后评估中的意义作一综述。

1 HPSE

1.1HPSE的功能及表达 HPSE是一种多功能蛋白，具有酶和非酶两种活性。作为一种葡萄糖醛酸内切酶，细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基底膜中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfateproteoglycans,HSPG)侧链-硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)只可由其降解[2]，并释放出一系列生物活性分子来参与多种病理生理功能。早在1970年于哺乳动物细胞中发现此类反应，随后在转移性黑色素瘤中也验证了有这种降解活动的存在。经过多年实验研究，证实了HPSE的表达不仅在胎盘、血小板、角质形成细胞和免疫细胞中比较显著，而且内皮细胞和结缔组织细胞中也表达少量的HPSE，同时也在炎症、细胞侵袭、肾脏病、妇科疾病和冠心病中发挥重要作用[3]。近年来HPSE的表达增加对AS斑块发生发展过程的影响成为广泛关注点。

1.2HPSE在AS中的作用 部分动物模型实验已经表明，AS的形成过程主要以炎症这一线索贯穿始终。由于斑块破裂部位有大量活化的免疫细胞，产生蛋白水解酶和炎症分子，HPSE表达于此，识别分离切割HSPG中的HS，并与其他蛋白水解酶共同重塑、破坏细胞外基质及基底膜的内部稳定结构，致使斑块屏障减弱[4-5]，促进AS的发展。也有研究应用HPSE转基因小鼠模型验证了HPSE的过表达会引起患者甘油三酯脂蛋白清除延迟和高密度脂蛋白胆固醇降低[6]，动脉内膜下脂质的过量堆积成为AS斑块形成的危险因素；红细胞膜上存在的游离胆固醇还可直接使斑块中心进一步增大,加快斑块进展速度。

在人颈动脉斑块钙化中，Aldi等[6]认为HPSE对其具有双重作用。在AS斑块的晚期，HPSE导致血管钙化可能主要与巨噬细胞源性破骨细胞介导的骨溶解有关，斑块中HPSE与巨噬细胞表达部位一致，随着AS斑块和炎症的进展，HPSE的表达会逐渐增高[7]，表明HPSE通过激活巨噬细胞而引起一些细胞因子的过量生成与斑块进展关系密切。

这些结果显示，HPSE可作为一种新的因子来预测临床冠心病患者病情发展。然而临床重点在于AS斑块进展为不稳定斑块之后，易破裂出血及血栓形成，引起血管狭窄甚至彻底阻塞，最终形成如急性心肌梗死、卒中等一系列严重的临床心脑血管事件。因此，探究使斑块易损的原因，以及如何进一步预防不稳定斑块的出现，就更为重要。

1.3HPSE与易损斑块 AS斑块的病理演变为初期的内膜增厚(pathologic intimal thickening, PIT)，经过各种途径和一系列细胞因子参与细胞外基质重塑过程，形成薄帽纤维粥样斑块(thin-cap firoatheroma, TCFA)[8],即易损斑块(Vulnerable patches，VP)或不稳定斑块。已有研究证实，稳定病变到不稳定病变进展过程中，HPSE的增加超过3倍[9]，表明HPSE既参与AS斑块的生成，又与其从稳定向不稳定的过渡紧密相关。

可能的发病机制如下：HPSE作用于HSPG中的HS链，加之其他酶的参与，干扰、破坏、重塑ECM和基底膜原本稳定的结构，引起斑块屏障减弱；还可以活化基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)降解ECM和胶原纤维来影响AS斑块的稳定性，是斑块破裂的关键因素[10]。

另有研究证实，HPSE促进人体颈动脉斑块中血管新生，通过降解内皮细胞下结构，促进内皮细胞的增殖和迁移，同时释放一系列血管生长因子[11]，为血管新生创造条件。新生幼稚血管可使红细胞和炎性介质作用于斑块中心。红细胞膜上的游离胆固醇、游离血红蛋白、磷脂可产生活性氧，扩大斑块坏死中心的面积；游离胆固醇还可直接使斑块中心进一步增大，斑块扩大伴随着缺氧和炎细胞浸润，可产生各种血管生成因子，新生血管增加，加之此时幼稚血管极易破裂，所以斑块内出血风险随之升高。高危易损斑块形成，使斑块内不稳定事件循环往复[12]。

虽然有研究表明急性心梗患者血清HPSE水平高于健康人群的9倍，稳定型心绞痛患者血清HPSE水平高于健康人群的3倍[6]，证实了HPSE对AS斑块从稳定到不稳定之间的过渡有显著影响，但Gurbuz等[12]通过病例对照研究包括92例经冠状动脉造影后血管狭窄超过70 %的稳定型冠状动脉疾病(Stable coronary heart disease,SCAD)患者和34例血管正常的对照组，发现SCAD患者的HPSE水平低于冠脉正常者，且低水平的HPSE可以预测SCAD，这与我们之前了解到的说法有所不同，可作为一定的理论参考。

可见HPSE通过一系列途径包括诱导血管新生来共同参与VP的形成，而HPSE的高表达还可促使血液产生高凝状态和血栓，在VP的基础上进一步增加ACS等疾病的发生风险。

1.4HPSE与血栓形成 有研究证实，HPSE可激活纤溶酶原，还可通过P38依赖信号通路诱导组织因子(tissue factor,TF)水平升高，非酶活性的HPSE可作为TF的辅因子促进TF与凝血因子VIIa形成复合物以参与凝血级联反应，同时HPSE也可使细胞表面组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)从内皮细胞表面脱落，且增加凝血因子X的表达水平，进而增加凝血活性[13]。研究还发现，HPSE与人颈动脉斑块中的纤维蛋白沉积高度重合[14]，因此HPSE过度表达与血液高凝状态紧密相关，也可进一步促进血栓形成。

另外，冠状动脉内血栓负担是ST段抬高型急性心肌梗死(ST-elevated myocardial infarction,STEMI)患者长期不良心血管事件和介入治疗后支架内血栓形成的高危因素。尽管使用了多种抗血小板和抗凝药物，高冠状动脉内血栓负担仍是一个很大的挑战[15]，就此Gurbuz等[10]通过研究HPSE与冠状动脉内血栓负担的关系，得出结论：高冠状动脉内血栓负担的急性心肌梗死患者与低冠状动脉内血栓负担患者相比，血清HPSE水平显著增高，而且，经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)术后无再流患者的HPSE水平更高，再次提示HPSE升高可能与血栓并发症有关。

总之，HPSE的过表达能够加速AS的发展和斑块内血栓形成，诱发急性心肌梗死、脑卒中等缺血性疾病。而在这些疾病的治疗过程中，血流重新灌注后对组织的刺激和一系列化学损伤比前期缺血更易导致严重的后果，更应引起关注。

1.5HPSE与缺血/再灌注损伤 心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)是指AS斑块破裂或继发血栓形成导致的冠脉部分或全部闭塞后，在有限的时间内再次获得血液流通，此时即使缺血的心肌重新被灌注，但心肌组织的损伤反而会进一步恶化[16]，是比较主要和常见的心血管疾病术后并发症。

近年来相关的研究主要集中在肾脏领域，如在肾脏移植中引起急性肾损伤和移植物功能延迟等，严重情况下可进一步导致肾间质纤维化。对此有实验用野生型和HPSE大量表达的小鼠通过夹闭双侧肾动脉来制作I/R模型[17]，结果显示，在实验中，肾动脉再灌注后HPSE表达增加，过多的HPSE在I/R后肾小管上皮细胞向间质细胞转化的过程中起着重要促进作用，HPSE过表达组的小鼠可能比野生型小鼠更易导致急性肾损伤。

虽然国内外尚未有文献报道关于HPSE与心肌细胞I/R损伤的关系，但由此可以猜测，HPSE在心肌细胞I/R中是否也可以过表达，进而引起一系列的细胞损伤、凋亡及转化，造成心力衰竭等严重的并发症。至于具体的机制，还需要进一步的实验研究和深入探讨。

综上，HPSE在AS斑块、VP、血栓形成和I/R等各个方面都发挥着重要作用，在临床冠心病诊断、治疗、甚至评估预后中不可或缺。抑制HPSE有可能成为治疗AS的新策略,最新研究已经证实一种人工合成的硫酸乙酰肝素类似物(proteoglycan545，PG545)可以抑制HPSE，显著减轻AS的严重程度[18]。新型抗肿瘤药(progen industries 88,PI88)作为肿瘤生长及转移抑制剂，在心血管病研究中也取得了一定的临床依据，可以抑制HPSE的表达并使其降解[19]，临床应用前景比较可观。而与此同时，COX-2也广泛涉及了AS斑块及VP的生成，不仅在I/R的组织或细胞中显著表达，近年来选择性COX-2抑制剂与心血管事件的研究也很受关注。

2 COX-2

2.1COX-2的功能及表达 环氧合酶(cyclooxygenase，COX)是引起花生四烯酸转化为前列腺素的重要酶，其有COX-1和COX-2两种亚型存在[20]：COX-1为结构型，在生理或病理情况下、正常动脉和AS病变处均能表达，位于血管、胃等组织器官中，主要维持正常的生理功能；COX-2为诱导促炎型，只在AS病变处或接受特定炎症刺激时才大量表达[21]，而未见于正常动脉。一定条件下磷脂酶A被激活，破坏膜磷脂，产生花生四烯酸，在COX的作用下生成前列腺素(prostaglandin，PG)，分别为PGE2、PGH2,后者在血小板内生成TXA2，有促进血小板的聚集和强烈的缩血管作用，在内皮细胞中生成前列环素(PGI2),具有抗血小板聚集和舒张血管作用，还在其他组织中合成PGD2,PGE2,PGF2等各种前列腺素，均发挥促炎作用[22]。目前大量研究证实，很多广泛的、复杂的病理生理反应都有COX及其代谢产物PG的参与，包括多种心血管疾病，其中COX-2与AS的发生发展过程密切相关[23-24]。

2.2COX-2在AS中的作用 COX-2及其代谢产物PG在各种炎症反应尤其是AS斑块中的表达显著升高，贯穿了AS的形成及VP的破裂、内皮细胞的损伤、泡沫细胞的形成等各个阶段，并与其严重程度相关。Liang等[25]的研究支持这一观点：通过AS转基因小鼠模型发现COX-2高表达于AS病灶，抑制COX-2可以明显减轻斑块病变程度，且参与AS斑块组成的如内皮细胞、平滑肌细胞、单核/巨噬细胞内均含有COX-2。值得注意的是，COX-2仅存在于AS病变处而非正常动脉中。

另外，亚临床AS是指有AS的危险因素如糖尿病、高血压、肥胖、高血脂等，但无相应的临床症状，经检测其中同样有COX-2表达的增高[24]，这很大程度上说明了COX-2可以作为一种新的标志物来早期预测AS的发展，从而降低临床心血管病致死风险。

因此，COX-2是AS形成发展中一种关键的因子，而COX-2长此以往的炎症刺激使得AS斑块从微小的病变转化为不稳定斑块，甚至被破坏形成血栓，进而引发急性缺血梗死事件。

2.3COX-2与VP COX-2可能通过一系列途径增加单核巨噬细胞黏附,并刺激其产生趋化因子，刺激平滑肌细胞迁移和增生，增加血管通透性，参与炎症反应，诱导炎性因子如前列腺素E2(PGE2)的产生，继而激活MPP，降解细胞外基质，引起斑块稳定性降低。巨噬细胞是AS斑块中最重要的促炎细胞，因此斑块中巨噬细胞的升高可能代表此斑块易损。研究证实斑块中巨噬细胞分布较多的位置上，COX-2和PGE2也集中表达，进而促进炎症反应导致蛋白水解、斑块稳定性下降[26]。另一项研究也发现，COX-2在易损斑块中的表达明显上调。提示COX-2不但参与AS的形成过程，更增加斑块的易损性。

此外，免疫系统的作用也展现在AS发生发展的各个环节。有实验通过小鼠易损的颈动脉斑块模型[27]，证实了调节性T细胞可以较大程度地抑制VP和巨噬细胞中COX-2的含量，抑制炎症反应，进而阻止AS的发展，使AS稳定性得以提高。

COX-2的表达涉及了AS斑块的形成及不稳定，不稳定斑块的破裂也势必会引起急性心肌梗死等疾病，有必要探讨COX-2在心梗的严重并发症如缺血再灌注损伤(I/R)中是否仍继续表达。

2.4COX-2与缺血/再灌注损伤(I/R) 有研究表明，I/R的发生使心肌细胞受到刺激，经过一系列复杂的病理生理机制引起COX-2表达上调，随后当其催化前列腺素生成的同时释放大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)，导致心肌细胞进一步损伤，并且心肌细胞受损和凋亡的程度随着COX-2水平的增高而增高[28]。使用选择性COX-2抑制剂可明显降低由I/R损伤引起的炎症因子和ROS的水平[29]，进而减轻心肌细胞的受损程度。有研究还发现，ROS减少的同时会引起一氧化氮升高，并缩小梗死面积，对心肌细胞和组织都有很大的益处。目前为止所有相关研究表明，COX-2与I/R确实存在很密切的关系，选择性COX-2抑制剂可大量用于I/R损伤及AS相关疾病的治疗，然而关于选择性COX-2抑制剂对心血管的影响机制十分复杂，说法不一，值得深入研究探讨。

2.5选择性COX-2抑制剂与心血管事件 非甾体抗炎药主要通过抑制COX来减少各种前列腺素的生成，以达到抗炎镇痛的效果，其中阿司匹林属于非选择性环氧合酶抑制剂，可抑制COX，阻断介导血小板的TXA2合成、抑制炎症反应，进而发挥抗AS作用。由于COX-2参与AS的发生发展，所以抑制COX-2可能延缓AS进程。1998年美国食品药品管理局(FDA)批准了第一个选择性COX-2抑制剂塞来昔布，随后通过基因敲除小鼠AS实验，证实了用选择性COX-2抑制剂塞来昔布能降低PEG2水平，可对抗炎症来抑制AS斑块的进展。也有实验采用低密度脂蛋白受体基因敲除小鼠为AS模型，给予选择性COX-2抑制剂罗非昔布，最终显著抑制了早期AS斑块的进展。

而后的临床药物应用和实验发现，选择性COX-2抑制剂阻碍AS进展的同时也产生了一系列不良的心血管事件。一方面可能是由于内皮细胞产生的前列环素(prostacyclin，PGI2)可以抗血小板聚集和舒张血管，所以最早人们认为，PGI2在冠心病患者中具有预防血栓形成的有益作用，猜测如果抑制COX-2可能会增加AS患者进一步的风险。同时VIGOR实验的后期分析显示了罗非西布确实可以增加心肌梗死率，特别是在高危患者中。另一方面，单核巨噬细胞中COX-2产生的PGE2和TXA2具有促进AS发生发展的作用，抑制COX-2可以对抗AS。所以不同细胞内的COX-2及其代谢产物对AS各种阶段的影响有所差异，可能是相反的、双重的作用。但也有研究表明，选择性COX-2抑制剂并不能抑制全部的PGI2，因为COX-1也可产生PGI2，而且机体也可以通过其他途径使内皮细胞产生舒张血管和抗血小板聚集物质如NO，并不只有COX-2一条通路，所以虽然目前选择性COX-2抑制剂对心血管的安全性仍存在争议，但从这一角度出发，其仍可以抑制炎症、对抗AS进而产生有益作用。

综上所述，虽然在AS及相关疾病中未发现HPSE和COX-2的关系，但Gawthorpe 等人通过对246个乳腺肿瘤标本进行免疫组化分析得出结论：HPSE是乳腺肿瘤转移到区域淋巴结的关键因子，而COX-2过表达可能是淋巴结阳性的独立预测因子[30]。Zeng 等[31]通过免疫组化检查了80例宫颈癌病例中HPSE、COX-2和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，结果证实HPSE和COX-2的表达与宫颈癌的淋巴管生成有关，并且HPSE、COX-2和VEGF-C的表达之间存在显著相关性。也有研究在胃印戒细胞癌中证实了HPSE和COX-2表达之间存在密切相关性。既往研究已经表明，HPSE可以通过激活NF-κB信号通路，增加肿瘤细胞中COX-2、白细胞介素-6(interleukin-6)、白细胞介素-1(interleukin-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNFα)、ROS的生成，作用于细胞膜表面HPSE受体，通过Src、Akt、p38等途径增加VEGF-A、VEGF-C的表达；非酶活性的HPSE还可以直接诱导COX-2，COX-2继而通过诱导原癌基因Bcl-2和各种生长因子的表达，促进肿瘤血管、细胞、淋巴结的增殖转移。这些发现证明HPSE通过调节COX-2的表达在肿瘤发生发展中有重要作用。

同时有研究证实，HPSE通过PI3K/Akt通路产生大量活性氧，当超过自身抗氧化防御系统平衡时，引发氧化应激，导致细胞凋亡，参与AS斑块和急性冠脉事件全过程，且与病变严重程度相关。而COX-2本身可以由斑块内炎症细胞产生，促进ROS的生成，加速斑块进展。所以AS斑块中，在HPSE和COX-2同时表达且参与整个氧化应激途径的前提下，HPSE是否同样可以通过诱导COX-2来共同参与AS斑块的形成和发展，抑制HPSE能否使COX-2生成减少进而维持AS斑块的稳定性，为临床治疗冠心病提供一定的理论依据，对此还有待于进一步临床实验及研究。