半夏泻心汤含药血清对人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR化疗敏感性的作用

伍建新，甘培尚，甘海苹，李金花

(1.甘肃省第三人民医院 中医科， 甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院 中医科， 甘肃 兰州 730000；3.兰州新区瑞岭雅苑社区卫生服务中心， 甘肃 兰州 730000)

胃癌是世界范围内最常见的癌症之一。据报道全球胃癌年龄标准化发病率为2.5～56.8/10万，死亡率为1.5～18.5/10万，随年龄增长而逐渐升高，严重威胁人民身体健康[1]。化疗常作为晚期胃癌患者一线治疗方式，但常因耐药性而致化疗失败[2]，因此寻找更加高效的药物以增强化疗敏感性至关重要。半夏泻心汤方出自张仲景《伤寒论》中治寒热错杂之痞证的代表方剂，常用于治疗慢性肝炎、早期肝硬化、慢性结肠炎、急慢性肠胃炎等疾病，研究发现半夏泻心汤可有效辅助治疗胃癌[3]，但对于胃癌化疗耐药性的研究鲜有报道。磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路参与调控肿瘤细胞的增殖、转移及耐药性，抑制该通路可增强胃癌细胞的化疗敏感性[4]，但半夏泻心汤能否通过调控该通路影响胃癌细胞的化疗敏感性尚未可知。鉴于此，本研究选取人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR进行体外细胞实验，探究半夏泻心汤通过调控PI3K/Akt/mTOR通路调节人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR化疗敏感性的作用与机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4只3～4月龄无特定病原体(SPF)级家兔，体重2.0～2.5 kg，购自嘉善县金兔兔业专业合作社，实验动物生产许可证号SCXK(浙)2020-0006，使用许可证号SYXK(浙)2020-0023。

1.1.2 实验细胞与试剂 半夏(江西百芝堂智慧大药房连锁有限公司，10047671784190)；黄芩、甘草、干姜、人参、大枣、黄连[康美智慧药房连锁(广东)有限公司，KMZH0522052、KMZH0522342、10042987812938、KMZH31101098、08226567、KMZH0522437]；人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR(上海富雨生物科技有限公司，FY-C816)；盐酸阿霉素(ADR)(北京凯诗源生物科技有限公司，SC02012)；PI3K抑制剂(LY294002，上海芮晖化工科技有限公司，R10262)；细胞凋亡检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-CK-A211)；PI3K、AKT、mTOR、细胞周期蛋白B1(cyclin B1)、细胞周期蛋白激酶抑制剂(p21)、抗凋亡基因(Bcl-2)、促凋亡基因(Bax)、磷酸脱氢酶(GAPDH)聚合酶链反应(PCR)引物[由赛默飞世尔科技(中国)有限公司合成]；四甲基偶氮唑蓝(MTT)细胞活力检测试剂盒、Trizol试剂、细胞总蛋白抽提试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒[赛默飞世尔科技(中国)有限公司，V13154、15596026、78505、23227]；兔抗人PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、cyclin B1、p21、Bcl-2、Bax、GAPDH单克隆抗体(一抗)，羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记多克隆抗体(二抗)(英国Abcam，ab245781、ab278545、ab179463、ab81283、ab32028、ab109268、ab212977、ab188224、ab32124、ab81083、ab181602；ab97051、ab6721、ab7090、ab97080、ab6112、ab7171、ab97195、ab98459、ab288151、ab205718、ab98467)。

1.1.3 实验仪器 Avanti JXN-26型高速冷冻离心机、CytoFLEX S型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特)；SpectraMax M5型多功能酶标仪[美谷分子仪器(上海)有限公司]；Quant Studio5型PCR仪(美国Thermo)；DYY-5D型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 半夏泻心汤含药血清制备 半夏泻心汤药物组成：半夏60 g，黄芩、干姜、人参、甘草各45 g，黄连15 g，大枣20枚药材饮片；加药材8倍量水浸泡30 min常规煎煮1.5 h，滤出煎液后加药材6倍量水同法煎煮1 h，合并煎液，离心过滤后浓缩至含生药2 g/mL的流浸膏[5]。根据既往研究方式[6]向家兔连续灌胃半夏泻心汤流浸膏3次，依据60 kg成人日服用量10倍药量计算家兔灌胃剂量为每次26 mL/kg。

1.2.2 细胞培养 用DMEM(含10%胎牛血清和1%双抗)培养人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR，3～4 d传1代，0.86 μmol/L ADR维持其耐药性，实验前1周停止用药。

1.2.3 MTT法检测半夏泻心汤含药血清的细胞毒性作用和对人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR耐药的逆转作用 取对数生长期人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR，调整细胞密度为5×103个/mL，接种至96孔板，分为空白组(仅添加DMEM培养液)、对照组(加等量人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR)、半夏泻心汤实验组(0、6.25、12.5、25、50、100 μL/mL，每个浓度设5个复孔)、ADR实验组(0、4.9、9.9、19.9、39.9、79.9 μg/mL，每个浓度设3个复孔)，常规培养48 h；加5 mg/mL MTT溶液(20 μL/孔)培养4 h，加二甲基亚砜震荡10 min，酶标仪检测细胞490 nm处吸光度值，计算半夏泻心汤含药血清最大非毒性剂量(细胞存活率≥80%的药物浓度)[7]和ADR半数抑制浓度(IC50)。

取半夏泻心汤含药血清最大非毒性剂量联合不同浓度ADR(5、9.9、19.9、39.9、79.9 μg/mL，每个浓度设3个复孔)作用于细胞，同上法检测细胞490nm处吸光度值，计算细胞逆转倍数(RF)[8]。

1.2.4 流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡率 取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，接种至6孔板，将细胞分为对照组、ADR组[23.72 μmol/L(ADR IC50的1/2浓度)ADR]、半夏泻心汤含药血清组[15.22 μL/mL半夏泻心汤含药血清]、ADR+LY294002组(23.72 μmol/L ADR+20 μmol/L LY294002)、ADR+半夏泻心汤含药血清组(23.72 μmol/L ADR+15.22 μL/mL半夏泻心汤含药血清)，每组设6个复孔。给药72 h后，无水乙醇固定过夜，离心取沉淀，重悬细胞加0.5 mL 碘化丙啶(PI)室温孵育30 min，上机测细胞周期；加膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素标记(Annexin V-FITC)和PI溶液各5 μL，37 ℃避光孵育15 min，上机测细胞凋亡率。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞PI3K、AKT、mTOR、cyclin B1、p21、Bcl-2、Bax信使核糖核酸(mRNA)表达 同1.2.4分组及给药处理后，Trizol法提取细胞中总RNA，逆转录为cDNA后行PCR反应：95 ℃ 10 min；95 ℃ 7 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 38 s，40次循环。引物序列见表1，2-ΔΔCt[9]计算相关基因表达量。

本项目的大豆制品褐变控制技术还有进一步提升的空间，比如虽然添加剂中焦亚硫酸钠的添加量符合国家标准，但由于亚硫酸盐对于人体具有一定神经毒性，我们想寻求一种更绿色、更健康的添加剂或工艺来代替焦亚硫酸钠。故本项目后续还将进行大豆制品无硫防褐变技术以及复合有机酸和金属离子[14]抑制褐变机理方面的研究。

表1 PCR引物序列

1.2.6 蛋白质印迹法检测细胞PI3K、AKT、mTOR、cyclin B1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平 同1.2.4分组及给药处理后，冰上加RIPA裂解液孵育30 min，离心收集上清，BCA法检测蛋白浓度；聚丙烯酰胺凝胶电泳后，蛋白转膜，封闭1 h后加相应一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，加二抗(1∶2 000)，洗膜，曝光，Image J分析蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 半夏泻心汤含药血清对人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR的增殖抑制作用 半夏泻心汤含药血清终浓度为25 μL/mL时细胞存活率小于80%；确定半夏泻心汤含药血清的最大非毒性浓度为15.22 μL/mL(见图1)。

图1 半夏泻心汤含药血清对人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR存活的影响

2.2 半夏泻心汤含药血清与ADR联用逆转人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR耐药性 与单用ADR组比，ADR联合最大非毒性浓度半夏泻心汤含药血清组细胞存活率下降(P<0.05或P<0.01，见图2)。单用ADR IC50值为47.44 μg/mL，药物联用 IC50值为21.76 μg/mL，两者比差异显著(P<0.01)，药物联用对细胞RF为2.18。选择23.72 μg/mL(1/2单用ADR时IC50浓度)作为后续实验的ADR浓度。

*、**：与单用ADR比较， P<0.05， P<0.01。

2.3 流式细胞术检测细胞周期分布结果比较 与ADR组比，ADR+LY294002组和ADR+半夏泻心汤含药血清组G2/M期细胞显著增多(P<0.01，见图3～4)。

*、**：与对照组比较， P<0.05， P<0.01；#、##：与半夏泻心汤含药血清组比较， P<0.05， P<0.01；△、△△：与ADR组比较， P<0.05， P<0.01；▲、▲▲：与ADR+LY294002组比较， P<0.05， P<0.01;A:对照组;B:半夏泻心汤含药血清组;C:ADR组;D:ADR+LY294002组;E:ADR+半夏泻心汤含药血清组。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率结果比较 与ADR组比，ADR+LY294002组和ADR+半夏泻心汤含药血清组细胞凋亡率显著增加(P<0.01)，见图5～6。

*、**：与对照组比较， P<0.05， P<0.01；#、##：与半夏泻心汤含药血清组比较， P<0.05， P<0.01；△、△△：与ADR组比较， P<0.05， P<0.01。

*、**：与对照组比较， P<0.05， P<0.01；#、##：与半夏泻心汤含药血清组比较， P<0.05， P<0.01；△、△△：与ADR组比较， P<0.05， P<0.01;A:对照组;B:半夏泻心汤含药血清组;C:ADR组;D:ADR+LY294002组;E:ADR+半夏泻心汤含药血清组。

*、**：与对照组比较， P<0.05， P<0.01；#、##：与半夏泻心汤含药血清组比较， P<0.05， P<0.01；△、△△：与ADR组比较， P<0.05， P<0.01。

2.5 实时荧光定量聚合酶链反应检测细胞PI3K、AKT、mTOR、cyclin B1、p21、Bcl-2、Bax mRNA表达结果比较 与ADR组比，ADR+LY294002组和ADR+半夏泻心汤含药血清组细胞PI3K、AKT、mTOR、cyclin B1、Bcl-2 mRNA表达显著减少(P<0.01)，p21、Bax mRNA表达增加(P<0.05或P<0.01)，见图7。

*、**：与对照组比较， P<0.05， P<0.01；#、##：与半夏泻心汤含药血清组比较， P<0.05， P<0.01；△、△△：与ADR组比较， P<0.05， P<0.01。

2.6 蛋白质印迹法检测细胞PI3K、AKT、mTOR、cyclin B1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平结果比较 与ADR组比较，ADR+LY294002组和ADR+半夏泻心汤含药血清组细胞PI3K、AKT、mTOR、cyclin B1、Bcl-2蛋白表达及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平减少(P<0.05或P<0.01)，p21、Bax蛋白表达显著增加(P<0.01，见图8～11)。

图8 各组细胞PI3K、AKT、mTOR、cyclin B1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR水平

*、**：与对照组比较， P<0.05， P<0.01；#、##：与半夏泻心汤含药血清组比较， P<0.05， P<0.01；△、△△：与ADR组比较， P<0.05， P<0.01。

图10 各组细胞cyclin B1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达

*、**：与对照组比较， P<0.05， P<0.01；#、##：与半夏泻心汤含药血清组比较， P<0.05， P<0.01；△、△△：与ADR组比较， P<0.05， P<0.01。

3 讨论

化疗是晚期胃癌患者的关键治疗手段之一，药物泵出增多、药物靶点变化、DNA修复活性增强、细胞凋亡途径的失活等可引发胃癌细胞的耐药性[10]，因此寻找能够提高胃癌化疗敏感性的药物对于胃癌的治疗具有重要意义。

细胞周期阻滞和凋亡对于癌细胞的化疗敏感性至关重要，研究发现诱导胃癌细胞凋亡和G2/M期阻滞可增加其化疗敏感性[11-12]。半夏泻心汤干姜、半夏辛开以化痰散结，黄芩和黄连苦降以清热癌毒，大枣、人参、甘草甘补健脾补虚；全方以辛开、苦降、甘补配伍，兼顾虚实，共奏化痰散结、健脾补虚、清解癌毒之功，且有研究发现半夏泻心汤具有抑制胃癌细胞增殖和侵袭，诱导胃癌细胞凋亡的功能[13]。本研究与上述报道一致，提示半夏泻心汤含药血清可能通过促进细胞凋亡、诱导细胞G2/M期阻滞而增强人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR化疗敏感性。

PI3K/AKT/mTOR通路在调控细胞生长、增殖、侵袭和凋亡、抵抗化疗和放疗等过程发挥重要功能，被认为是肿瘤细胞耐药治疗的潜在新靶点[14]，Mu等[15]指出通过调控PI3K/AKT/mTOR通路，调节耐药胃癌细胞凋亡和细胞周期阻滞可促进耐药胃癌细胞舍曲林致敏作用。cyclin B1和p21是重要细胞周期调控蛋白，两者表达失衡可引发细胞周期阻滞进而引发细胞凋亡，而Bcl-2和Bax分别为Bcl-2家族的代表性抗凋亡与促凋亡基因，在肿瘤细胞耐药性中发挥重要功能[16-17]；Liu等[18]指出通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，调控cyclin B1和p21表达能够克服顺铂耐药而抑制卵巢肿瘤发生；Tang等[19]指出通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，抑制Bcl-2表达，促进Bax表达，可使耐替莫唑胺的胶质母细胞瘤细胞对化疗敏感。有研究指出干姜提取物、黄芩苷、人参皂苷及黄连碱可通过调控PI3K/Akt/mTOR通路调控癌细胞侵袭和凋亡[20-23]。本研究与上述报道一致，提示半夏泻心汤含药血清可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，抑制cyclin B1、Bcl-2表达，促进Bax和p21表达增强人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR化疗敏感性。也有研究指出半夏泻心汤可通过调控IL-6/JAK/STAT3通路，增强顺铂耐药胃癌细胞的化疗敏感性[24]，提示半夏泻心汤对胃癌耐药细胞化疗敏感性的增强作用是多信号通路协同作用的结果。

综上所述，半夏泻心汤含药血清可增加人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADR化疗敏感性，可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，抑制cyclin B1、Bcl-2表达，促进Bax和p21表达发挥增强功能。