动物源金黄色葡萄球菌的流行特点及耐药机制研究进展

2022-12-25李亚菲李伟陈林曾振灵

中国抗生素杂志 2022年9期

李亚菲李伟陈林曾振灵,*

(1 广东省农业科学院农产品公共监测中心，广州 510640； 2 华南农业大学兽药研制与评价重点实验室，广州 510642)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种常见的人畜共患的条件性致病菌，能够在人和动物的鼻腔和皮肤表面进行定植。研究表明，50%的成年人是持续性或间歇性的金黄色葡萄球菌携带者[1]。金黄色葡萄球菌携带大量的毒力因子，能够引起广泛的感染，从常见的皮肤感染如疖病和脓疮等，到严重的深部感染，如心肌炎、肺炎和乳房炎等[2]。兽医临床上，金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎[3]等动物疾病重要的病原菌。作为对人和动物健康最具威胁的细菌之一，金黄色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcus aureus，MRSA)的耐药性问题，不仅对临床治疗造成影响，而且已成为影响公共卫生安全问题之一。

我国不同来源的动物养殖场环境、动物粪便拭子、屠宰场、宠物医院等分离的金黄色葡萄球菌呈现多重耐药的特点。王豪举等[4]对重庆市动物源金黄色葡萄球菌流行调查表明，25株金黄色葡萄球菌对常用23种抗菌药呈现不同程度耐药，其中氨苄西林、青霉素G、四环素、强力霉素、林可霉素的耐药率超过60%。李淑敏等[5]调研了我国6个省份食品动物源金黄色葡萄球菌的分离特点及耐药情况，其中MRSA菌株对常见的抗菌药物如氟苯尼考、四环素、庆大霉素等的耐药率超过90%。我国幅员辽阔，各地区流行情况不尽相同，金黄色葡萄球菌的流行和耐药特征常处在动态变化中。同时，动物源耐药金黄色葡萄球菌可传播给动物密切接触者，也可通过食品链在消费者中传播，进而可能在人群中扩散，这无疑增加了耐药性散播的风险。因此，有必要了解动物源金黄色葡萄球菌的流行特点及其耐药特征，并对其进行长期监测，以降低耐药菌株传播的风险。

2 金黄色葡萄球菌的分子分型及流行特点

金黄色葡萄球菌在不同地区的流行有一定的规律性，分子分型能够揭示菌株间的亲缘关系，有利于研究菌株的流行分布和传播机制。目前金黄色葡萄球菌的分子分型方法主要有多位点序列分型(mutilocus sequence typing，MLST)、脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)、spa分型，以及用于MRSA分型的SCCmec分型和dru分型等。

在2005年荷兰出现猪源MRSA感染人的病例[6]以前，动物源金黄色葡萄球菌并未引起足够的重视，但随着动物源MRSA感染人的报道逐渐增多，畜禽相关MRSA(livestock associated MRSA，LA-MRSA)逐渐引起人们的重视，并在世界范围内广泛关注。LAMRSA不仅能够在畜禽之间相互传播，还可以定植感染人，对公共卫生安全具有潜在威胁。

我国LA-MRSA的主要流行克隆型为ST9-t899。Cui等[7]调查了我国陕西、河北、四川和湖北地区养殖场和屠宰场中猪源和人源MRSA的携带情况，分离获得的MRSA均为t899型，包括同属于CC9克隆系的3种ST型(ST9、ST1376和ST1297)。Yan等[8]从黑龙江地区屠宰场分离的MRSA全部属于ST9型。Li等[9]报道的44株猪源MRSA除1株属于ST1376-t899型外，其它均属于ST9-t899型。寇芮等[10]对南京地区获得的4株猪源MRSA进行MLST分型发现，其中3株属于ST9。樊润等[11]对河南省猪源MRSA的耐药性及分子分型进行了研究，结果显示分离株主要为ST9-t899型，此外还检测到ST1376-t899、ST2454-t899、ST9-t4132和ST9-t1334型，猪源MRSA的遗传谱系呈现多样化，存在区域性流行的特点，不同养殖场或屠宰场也存在优势谱型。MRSA ST9感染人的临床报道较少，Yu等[12]在我国人医临床检测到3株对喹奴普汀/达福普汀耐药的ST9-t899 MRSA，3名感染MRSA的患者并非家畜饲养员，也没有与家畜保持密切接触，导致人感染的LA-MRSA-ST9菌株的起源尚不清楚。Liu等[13]在广州某医院中检测到ST9-t899 MRSA。另外，在荷兰也发现ST9-t899 MRSA感染人的案例[14]。

相较于欧美等地区，亚洲地区LA-MRSA的主要流行克隆属于CC9。Neela等[15]报道了马来西亚的猪和饲养员中MRSA为MRSA-ST9-SCCmecV型，spa型有t4358和t1784。Larsen等[16]在泰国的猪场中发现ST9 MRSA，其spa型为t337，并携带SCCmecIX。Vestergaard等[17]在泰国猪场中除检测到MRSA ST9外，还检测到ST9的变体ST2136和ST2278，同属于克隆群CC9。Lo等[18]于2009—2010年在中国台湾西部11个县的生猪交易市场的150个养猪场收集了299份猪的鼻腔样本，MRSA阳性农场的检出率为48.7%，而猪中MRSA的携带率为42.5%，MRSAST9-t899是主要克隆型，在SCCmec型的鉴定中，检测到C2mec基因复合体，但大多数菌株缺乏ccrC基因。与之不同的是，日本LA-MRSA的主要流行型是ST221[19]，韩国则是ST398及其变体ST541[20]。

LA-MRSA在动物群体中高度流行，导致环境和空气经常被LA-MRSA污染，并可作为人感染的传播源。Bos等[21]研究了农场工作或生活的人在含有ST398 MRSA的空气中的暴露水平与鼻腔定植ST398 MRSA的相关性，研究表明长期暴露于ST398 MRSA环境是鼻腔定植LA-MRSA的一个重要因素，降低ST398 MRSA在空气中的水平是预防LA-MRSA的重要措施。Fox等[22]调查了英格兰西北部生肉零售店MRSA的流行分布，从鸡源、猪源和火鸡源样品中检测到ST398 MRSA，其中2株鸡肉中检测到的MRSA与人类报道中的一个亚分支相同，表明家禽肉可能是引起人医临床感染ST398 MRSA的来源。在对巴塞罗那6家养猪场密度较高的地区养老院中204名居民携带MRSA状况的研究中发现，15.7%的人在鼻腔中检测到MRSA定植，其中15.6%的MRSA阳性居民发现了MRSA ST398，这些居民大多数与养猪场有直接或间接接触[23]。

目前，对猪源LA-MRSA的研究较多，ST398是最早发现且最常见的流行克隆型，自在荷兰发现ST398 LA-MRSA以来，德国、丹麦、意大利等国家陆续被报道，目前已分布于欧洲、北美洲、大洋洲、非洲、亚洲的多个国家和地区。ST398 MRSA的宿主广泛，除定植猪外，还在马、牛、鸡、兔、羊等多种畜禽动物和野生动物体内发现。Agnoletti等[24]在集中饲养的家兔和与农场有关的人群中发现MRSA ST398，进一步揭示了MRSA可以在人和动物之间相互传播。Porrero等[25]调查了野生动物中MRSA的流行情况，从马鹿、野猪等野生动物身上分离获得的13株MRSA均属于ST398和ST1。ST398虽然定植于生猪中，但却极少引起动物的感染，其主要威胁在于ST398能够定植于养殖场工作人员，从而引起细菌感染，另外，ST398可通过环境、食品链等途径传播到与畜禽没有直接接触的人群中。

不同于猪源MRSA，牛源MRSA的流行呈现多样化。Li等[26]在陕西省患乳房炎奶牛源金黄色葡萄球菌的调查中发现MRSA的检出率较低，121株金黄色葡萄球菌中仅检出8株MRSA，且仅有1株检出mecA基因，为ST71-t524-SCCmecⅣa型。王登峰等[27]从54株牛源金黄色葡萄球菌中鉴定出6株MRSA，均携带mecA基因，分别为ST9-NT型(n=1)、ST97-Ⅳ(n=3)、ST965-Ⅳ型(n=1)和ST6-Ⅳ型(n=1)。Yi等[28]从新疆地区牛乳汁中分离到56株MRSA，获得7种spa类型(t034、t269、t4030、t114、t35、t189、t7589)以及12种MLST型，其中ST398和ST2393是最常见的类型，并发现3株在人医临床中流行的ST188 MRSA。最近一篇报道发现我国健康牛奶中LA-MRSA ST398的存在[29]。Mistry等[30]调查了印度引起奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的临床分离株的流行及分子特征，从牛奶样品中分离获得的39株金黄色葡萄球菌表现为多种MLST型(ST72、ST88和ST239)和spa型(t2526、t9602)，所有菌株对利奈唑胺敏感，但19株金黄色葡萄球菌mecA基因阳性。Mcmillan等[31]从澳大利亚维多利亚州原料奶(奶牛、山羊和绵羊)中分离到30株金黄色葡萄球菌，牛奶源分离株分为5种ST型，山羊和绵羊分离株为ST133或其变异体；牛奶源菌株主要分为CC1、CC5、CC8、CC97和CC705，而山羊和绵羊分离株为CC133。

值得注意的是，Bhattacharyya等[32]报道了在牛奶和山羊奶中检测到耐万古霉素金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistantStaphylococcus aureus，VRSA)。Wu等[33]在患乳房炎的奶牛样品中获得1株ST9-t899 MRSA，分析其基因组结构发现该菌株携带新的SCCmec结构，即SCCmecXII。Schmidt等[34]对牛乳腺炎样品和与之密切接触的人鼻腔拭子样品中分离获得的158株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin sensitiveStaphylococcus aureus，MSSA)进行遗传特征分析，从牛源金黄色葡萄球菌中鉴定出7个ST型，包括ST8、ST97、ST351、ST352、ST508、ST2992和一种新的序列型ST3538，PFGE分析进一步说明金黄色葡萄球菌遗传具有多样性，牛源和人源分离株无显著差异，在人源中获得属于牛源中流行的ST97和ST352型，在牛源中亦检测到人源中流行的ST8型，表明金黄色葡萄球菌能够人类和奶牛之间相互传播，提示应加强病原菌在人和动物之间双向传播的监测。牛源金黄色葡萄球菌的分子克隆呈现多样性，无论MRSA还是MSSA中均存在多种ST型，这可能与奶牛中金黄色葡萄球菌携带率高有关，有利于各种克隆型的金黄色葡萄球菌在牛群之间以及牛与人之间传播，亦利于MSSA菌株向MRSA菌株演变。

3 金黄色葡萄球菌的耐药机制

金黄色葡萄球菌适应能力强，可通过产生灭活酶和修饰酶、靶位改变、外排作用、生物被膜等机制，能够迅速对新的抗菌药物产生耐药性。

金黄色葡萄球菌可以产生磷酸转移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶3类氨基糖苷类修饰酶，从而对氨基糖苷类药物耐药。金黄色葡萄球菌流行的相关耐药基因有aph(3＇)-III、aac(6＇)-aph(2＇＇)、ant(6)-Ia和aadD等。氨基糖苷类耐药基因aac(6＇)-aph(2＇＇)、aadD及aadE等常出现在猪源MRSA中，而aph(3＇)-III和ant(6)-Ia等则常出现在与人有关的MRSA中[35]。李君[36]在分离的所有猪源MRSA中检测到addD基因，部分菌株中含有aacA-aphD基因，且aacA-aphD基因的流行呈逐年上升趋势。另外，多重耐药基因cfr可编码甲基化转移酶，介导林可胺类、酰胺醇类、截短侧耳素类、以及人医重要的噁唑烷酮类药物耐药[37]。Denis等[38]检测了48株ST398 MRSA中tet(M)和tet(K)的携带情况，其携带率分别为100.0%和47.9%。

金黄色葡萄球菌由于产生了β-内酰胺酶导致对对β-内酰胺类抗生素耐药，这种酶能够水解青霉素和氨苄西林等药物β-内酰胺环结构中的酰胺键，从而使药物失活，编码β-内酰胺酶的基因是blaZ。金黄色葡萄球菌产生青霉素结合蛋白(penicillin binding protein，PBP，称为PBP2a)，导致其对甲氧西林耐药。该蛋白对大多数β-内酰胺类抗生素的亲和力低，在抗生素压力下能够取代正常的PBPs从而产生耐药性。PBP2a主要由mecA基因编码，位于染色体的SCCmec结构中。目前，blaZ和mecA基因在动物源金黄色葡萄球菌等中广泛存在，牛乳源金黄色葡萄球菌中blaZ的携带率达63.1%[39]。

靶位突变导致药物与靶位结合量减少是金黄色葡萄球菌对药物耐药的重要原因。喹诺酮类药物结构决定区的靶位(DNA旋转酶和拓扑异构酶 IV)突变，导致金黄色葡萄球菌对喹诺酮类药物的亲和力下降，从而产生耐药[40]。23S rRNA及核糖体蛋白L3的突变，可引起金黄色葡萄球菌对截短侧耳素类药物耐药。编码ABC转运蛋白的νga基因和lsa(E)基因可介导细菌对截短侧耳素类药物的耐药。νga(C)基因主要在动物源MRSA CC398中发现[41]。lsa(E)基因可介导大环内酯类-林可胺类-链阳菌素B类(macrolides,lincosamides and type B streptogramin,MLSB)的多重耐药，常与其它耐药基因形成多重耐药基因簇，还含有erm(B)、lnu(B)(林可胺类耐药基因)、aacAaphD(氨基糖苷类耐药基因)、aadE(氨基糖苷类耐药基因)和spw(氨基糖苷类耐药基因)，该基因簇常存在于猪源ST9 MRSA中[42]。

外排作用是金黄色葡萄球菌产生耐药的另一原因。多重耐药泵主要易化子超家族(MFS)、小多重耐药家族(SMR)、多药及毒性化合物外排家族(MATE)、ATP结合盒超家族(ABC)和耐药节结化细胞分化家族(RND)，这些多重耐药泵可分别作用不同的底物，导致细菌耐药。optrA基因编码ABC转运蛋白，介导酰胺醇类和恶唑烷酮类的多重耐药。外排泵耐药基因fexA、fexB和pexA等介导金黄色葡萄球菌对酰氨醇类药物耐药。

金黄色葡萄球菌可形成生物被膜，使菌株在不利的环境中存活。形成生物被膜后的菌株，不仅减少菌株被机体清除的风险，还增加了对抗菌药物的抵抗性。当生物被膜存在时，抗菌药物的作用效果可减弱10～1000倍。生物被膜的形成是一个复杂的过程，形成机制也存在一定的争议。一般包括定植(attachment)、黏附(multiplication)、聚集(exodus)、成熟(maturation)、散播(dispersal)5个阶段[43]。目前认为多糖胞间黏附素(polysaccharide intercellular adhesin，PIA)是金黄色葡萄球菌生物被膜形成过程中的关键因子，由ica操纵子编码，包括icaR调节基因及icaADBC生物合成基因、细胞外eDNA以及相关蛋白共同作用的。

此外，可移动元件是细菌耐药性传播的重要载体。金黄色葡萄球菌可通过质粒、插入序列、转座子及可移动基因岛等途径获得耐药基因。SCCmec元件除携带mecA(或mecC)基因外，常携带多种其它的耐药基因如aadD、spc和cfr等。质粒作为耐药基因的载体，在耐药基因的水平转移中发挥了重要作用，同时本身也是携带耐药基因转座子的载体。含有lsa(E)等耐药基因的多药耐药基因簇常存在于猪源ST9 MRSA的质粒中[44]。猪源MRSA ST398分离株的质粒pUR1902携带erm(T)、tet(L)和aadD等多种耐药基因，耐药基因的两侧是ISSau10，说明插入序列可能在质粒重组中发挥重要作用[45]。