内质网应激介导的四氯化碳暴露诱导小鼠蜕膜细胞表面CRT表面异常表达的应用研究

万莉，邓晓风，毕媛媛，唐玲，代青

（贵州省贵阳市第二人民医院，贵州 贵阳 550081）

0 引言

自然流产的致病机理较多，胎停育、解剖因素、内分泌因素、遗传因素等多种原因均可引发。针对既往有过胎停育和自然流产史者，应在下次怀孕前找到病因，以防范可能存在的风险。常规电化学发光内分泌和抗胚胎抗体、阴道镜、动态数字化子宫输卵管造影、阴道四维彩超等均有助于了解宫腔形态。为进一步提升临床检查成效，拟定采用动物实验模型以进一步提升临床效果，为改善患者预后提供有效借鉴[1,2]。内质网应激介导的四氯化碳暴露诱导体外实验的研究，通过构筑小鼠实验模型，以此达到较佳的临床效果[3-5]。现就内质网应激介导的四氯化碳暴露诱导小鼠蜕膜细胞表面CRT表面异常表达分析如下。

1 研究内容和方法

1.1 一般材料

利用四氯化碳建立小鼠蜕膜细胞变性模型，使用体积分数为10%的四氯化碳橄榄油溶液给小鼠腹腔注射，连续注射三天。总共分为四组小鼠，每组六只，其中一组为对照组。每注射完24h后处死一组外加两只对照组。

1.2 方法

应用体外实验，采用Western Blotting技术，研究四氯化碳暴露引起内质网应激并诱导小鼠蜕膜细胞表面CRT异常表达进而抑制血管生成，最后促进流产发生的分子机制。将妊娠期小鼠进行四氯化碳处理后，将小鼠分为对照组及实验组，利用qRT-PCR、Western Blotting、流式细胞术检测内质网应激下小鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞CRT表达情况；通过合成si-CRT并转染至小鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞以检测CRT mRNA及蛋白表达量，同时运用qPCR技术来研究抑制CRT表达后对蜕膜血管生成的影响。

内质网应激模型的建立——筛选四氯化碳（carbon tetrachloride，CCL4）刺激浓度：（1）将小鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞按5×10 5个细胞量铺于96孔板中，待状态稳定后弃去上清；（2）将CCL4按0、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L、1000μmol/L浓度梯度加入细胞中，并设置多个复孔；（3）待药物刺激细胞12h后，加入200μl/孔MTT于细胞中，37℃恒温箱避光孵育4h；（4）弃去上清，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，置于多功能荧光酶标仪，在测定波长490nm处测定光吸收值（optical density，OD值）；（5）测得OD值求平均值后，绘制细胞生存曲线。

一般方法：（1）合成并检测si-CRT的表达：①在文献中查找si-CRT序列；②将si-CRT序列转染后检测CRT mRNA及蛋白表达量检测；（2）qPCR检测si-CRT转染至小鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞后CRT的表达；（3）Western Blotting检测si-CRT转染至小鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞后CRT的表达。（4）研究抑制CRT表达对小鼠蜕膜血管的影响：①在6孔板中，将si-CRT转染至小鼠胎盘绒毛膜滋养层细胞并培养24h；②收集细胞，通过qRT-PCR检测蜕膜组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、VEGFR-2、sVEGFR-1的表达的含量：采用TRlzol法抽提蜕膜组织中总RNA，测定RNA浓度，经逆转录得到cDNA。以β-actin为内参，按照引物序列进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火延伸10s，40个循环，在用多元定量PCR仪上反应，采用△△C（t）计算基因的相对表达量。

2 结果

内质网应激介导的四氯化碳暴露诱导小鼠蜕膜细胞表面CRT表面异常表达，其分子机理可能为内质网应激发生后促进CRT转录因子的表达与活化，CRT水平在细胞核内参与生脂相关酶如VEGF水平等基因的诱导表达，四氯化碳暴露引起内质网应激并诱导小鼠蜕膜细胞表面CRT异常表达进而抑制血管生成，最后促进流产发生。

3 讨论

ART助孕后及正常妊娠后稽留流产患者蜕膜组织中CRT表达较正常妊娠患者蜕膜中增加，流产患者蜕膜组织中CRT与IAP含量存在负相关关系，可能存在某种机制调节二者在蜕膜组织中的表达，共同作用母-胎界面上母体细胞稳定的维持；CRT在蜕膜细胞中均呈阳性表达，均位于细胞浆及胞膜[6-10]。ART稽留流产组和自然妊娠稽留流产组CRT表达。蜕膜组织中CRT的异常表达,可能对稽留流产进程发挥着重要作用；Western Blotting检测患者蜕膜组织中CRT表达极显著升高，CRT在蜕膜组织中定位于细胞浆及胞膜呈阳性表达；稽留流产组患者蜕膜组织中CRT的积分光密度值水平。早期先兆流产的发生可能与CRT在绒毛和蜕膜组织中的高表达并介导凋亡相关；CRT阳性信号定位于绒毛两层滋养层细胞的胞质和胞膜上。CRT 在自然流产者蜕膜和绒毛细胞中表达上调，与自然流产的众多因素密切相关，但二者之间的关系尚待深入研究。CRT是内质网中主要的Ca2+结合蛋白,作为一种多功能的分子伴侣,CRT参与了细胞多种生理功能的调节,并参与多种疾病的发生和发展进程,如神经系统疾病、肿瘤和自身免疫疾病。CRT及Caspase-3在早期自然流产蜕膜及绒毛组织中表达高于正常早孕组；稽留流产组蜕膜及绒毛组织中CRT及Caspase-3的表达均高于先兆流产组；CRT与Caspase-3呈正相关。CRT及Caspase-3异常表达可能参与ESA的发生机制,高表达的CRT也可作为判断是否有自然流产危险的标志之一[11-15]。在妊娠中，胎盘细胞内质网的氧化应激与抗氧化防御系统保持着动态平衡。当氧化应激的程度超过防御系统的抵抗力或者抗氧化系统的功能出现障碍时，会诱发过度的氧化应激，进而高活性分子增多并不能被有效清除，引起内质网微环境的改变。近来研究表明，在自然流产患者蜕膜组织中，细胞内质网处于应激状态，大量错误折叠或未折叠的蛋白堆积于内质网，此时对分子伴侣的需求量增加，CRT的合成也相应增加，CRT的vasostatin片段会抑制内皮细胞的增生，使得新生血管无法生成，抑制蜕膜血管的重建，从而引起自然流产。

基于此，在妊娠中，胎盘细胞内质网的氧化应激与抗氧化防御系统保持着动态平衡。当氧化应激的程度超过防御系统的抵抗力或者抗氧化系统的功能出现障碍时，会诱发过度的氧化应激，进而高活性分子增多并不能被有效清除，引起内质网微环境的改变。CRT的合成也相应增加，CRT的vasostatin片段会抑制内皮细胞的增生，使得新生血管无法生成，抑制蜕膜血管的重建，从而引起自然流产。据此研究内质网应激诱导CRT异常表达，从而抑制蜕膜血管生成并引起流产的作用机制至关重要，具有良好的理论依据。从妊娠过程中外界因素诱导内质网应激异常调控，并诱导蜕膜组织CRT表达异常进而抑制蜕膜血管生成引发流产；内质网应激诱导CRT高表达在自然流产中发挥重要作用。研究内质网应激促发相关细胞死亡途径而导致CRT异常表达增高最终导致流产；VEGF是血管生成最重要的调节因子，在早期妊娠中起着至关重要的作用[16,17]。通过敲低CRT表达后，研究小鼠蜕膜血管调节因子的表达情况。

CRT是分子量为46.6KD的结构和功能上都高度保守的钙离子结合蛋白，主要存在于细胞内质网以及胞浆和胞膜上。CRT分为N-末端区、P区、C-末端区三个结构和功能区。N-末端区含有180个氨基酸残基（1-180），序列最为保守，有球状的β-折叠篇，是CRT的分子伴侣功能区。P区（181-280氨基酸残基）富含脯氨酸，由两条发卡结构的β-折叠篇构成，是具有低容量和高亲和力特性的钙结合位点。C-末端含有作为内质网滞留信号的四肽赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸，即KDEL序列，可以引导CRT的靶向定位并且参与钙离子的储存 ，钙离子紊乱的情况下会阻碍胚泡的发生发育，并且ER-CRT-Ca2+稳态对于卵母细胞的成熟和胚胎的发育起着非常重要的作用。当内质网应激启动，需要大量的CRT去修正错误折叠和未折叠的在腔内聚集的蛋白并且调节钙离子的平衡。在正常情况下，内质网应激可以激活CRT内分子伴侣的表达及其他保护机制来抵制应激作用，从而起到保护细胞的作用。然而，当细胞处于过度或者长期内质网应激状态时，其保护机制无法抗衡损伤，便会诱发内质网相关的细胞死亡途径，此时表现出过度凋亡，阻止了胚胎的进一步发育，诱发先兆流产。在胚胎发育早期，血管新生是胚胎植入和子宫内膜发育最基本的条件。VEGF是一种作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子及血管生成最重要的调整因子，一方面能促进血管内皮细胞及滋养细胞的分裂和迁移，促进新生血管的形成，另一方面可以调节血管的通透性，在受精、胚胎着床、胎盘血管的形成及胎儿生长发育中发挥重要作用。多年前已有学者指出子宫内膜血管形成异常与自然流产中VEGF表达较正常早期妊娠明显降低，这可能与CRT高表达有关。在自然流产蜕膜组织中，细胞内质网处于应激状态，大量未折叠或错误折叠的蛋白堆积在内质网中急需折叠，因而对分子伴侣的需求增加，CRT的合成也相应增加，CRT的N端结构域1-180位氨基酸片段即vasostain片段作为一种血管生成抑制因子，可以有效专一地抑制内皮细胞的增生，从而使得新生血管无法形成，抑制蜕膜血管的重建，最终引发自然流产。在早期妊娠中CRT可以通过抑制血管生成而导致自然流产的发生。不良状态的内质网应激、CRT的异常表达及蜕膜组织血管的异常形成皆与自然流产存在一定联系，但三者之间的联系及引起自然流产的作用机制仍是研究的难点和热点。因此我们提出一下科学假设：通过对妊娠期小鼠进行CCL4处理后，观察小鼠胎盘生长发育及其病理变化，并在体外实验中研究这种刺激是否会引起内质网应激过表达进而诱导CRT表达异常并且抑制蜕膜血管生成，最终引起流产的发生。

综上所述，小鼠蜕膜细胞表面CRT表面异常表达受内质网应激介导的四氯化碳暴露诱导效应增加影响，可作为自然流产患者临床疾病概况的预期方式，以此达到较佳的效果。