基于高通量RNA-Seq技术探讨补阳还五汤治疗小鼠脑梗死的作用机制

刘亚杰，李玉娣，黎凯锋，陈哲锋，凌莉

卒中是世界范围内致死率和致残率最高的疾病之一，脑梗死占卒中的60%～80%，给社会和家庭带来沉重负担。因此，迫切需要研究减轻脑梗死后组织损伤、促进神经功能恢复的药物。脑梗死的病理损伤机制非常复杂，涉及兴奋性氨基酸毒性、氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等多个方面，这可能是针对单一靶点的药物临床疗效欠佳的原因。近年来的研究表明，中药复方可能作用于脑梗死后病理损伤的多个分子靶点和信号通路，在脑梗死的治疗方面具有独特优势[1-3]。补阳还五汤是清代名医王清任所创的经典名方，数百年来在治疗急性卒中及其后遗症方面具有较好的临床疗效。现代研究表明，补阳还五汤对脑梗死动物模型有明确的神经保护作用[4-5]。但其作用的分子机制尚不完全清楚。本研究采用高通量RNA-Seq技术分析补阳还五汤对急性脑梗死小鼠缺血脑组织基因表达的影响，从多个分子靶点的角度阐明补阳还五汤治疗小鼠脑梗死的分子机制，为补阳还五汤治疗脑梗死提供新的思路与实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物 补阳还五汤由生黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍5 g、川芎3 g、地龙（去土）3 g、桃仁3 g、红花3 g组成。本研究中所有中药饮品均由深圳市中医院药房提供。水煎浓缩成含生药1.859 g/mL，于4 ℃冰箱保存。根据人与小鼠等效换算，按18.59 g/kg小鼠体重生药量每天予小鼠灌胃。

1.2 实验动物、脑梗死模型制作和实验分组共购买30只10周雄性C57BL/6J小鼠（体重20±3 g，来自广东省实验动物中心）。饲养于温度20～23 ℃，相对湿度40%～60%的无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级动物房，自由进食与进水。本实验已通过南方医科大学深圳医院动物伦理委员会批准（动物伦理批号：2022-001）。

参照本课题组前期方法制作左侧永久性大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的小鼠脑梗死模型12只[6]：先予3%水合氯醛腹腔麻醉，在手术显微镜下于左眼裂外侧与左耳根连线中点切开皮肤，分离肌肉，在左侧颧弓根前方颞骨上钻开一个直径为1 mm的骨窗，暴露左侧大脑中动脉，在大脑中动脉跨越嗅束的远端采用双极电凝器将其凝闭，然后结扎双侧颈总动脉7 min，逐层缝合切口并常规消毒。术后采用电热毯使小鼠体温保持在37±0.5 ℃。小鼠麻醉清醒后置于SPF级动物房饲养。

将脑梗死小鼠随机分为治疗组和模型组（每组6只小鼠），分别从MCAO术后1 d起每天灌胃生药量为18.59 g/kg的补阳还五汤或等容积蒸馏水，每天分两次灌胃，连续7 d。假手术组小鼠（6只）仅于同一部位开颅并暴露左侧大脑中动脉，但不作电凝，完毕缝合术口。

1.3 神经功能评分 于治疗前和MCAO术后第7天采用改良神经损伤严重程度评分（modified neurological severity scores，mNSS）对各组小鼠的神经功能进行评估[包括行为测试（偏瘫及自由行走）、平衡木测试和反射缺失][7]，评分越高提示神经功能缺损越严重。

1.4 小鼠脑组织RNA提取和cDNA文库制备MCAO术后第7天，将治疗组和模型组小鼠麻醉后取脑梗死灶周组织，同时取假手术组小鼠相应部位脑组织，使用总RNA抽提试剂提取总RNA。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。采用RNA逆转录试剂盒将总RNA反转录合成互补DNA（cDNA），对纯化的双链cDNA进行末端修复，通过PCR扩增和纯化构建cDNA文库，然后对文库进行质检。

1.5 转录组测序及数据分析 文库构建并质检合格后采用Illumina HiSeg 4000平台进行高通量测序（每组3只）。测序得到的原始数据经过滤（去除带接头的和低质量的数据）得到高质量数据用于分析。本研究采用Hisat 2软件进行基因组比对，采用HTSeq软件对各样品的基因表达水平进行分析，将组间差异基因表达的阈值设定为|log2（fold change）|≥0.58，且P＜0.05。

1.6 测序结果的验证 为验证高通量测序结果的可靠性，本研究采用简单随机法挑选6 个差异表达基因进行定量反转录PCR（quantitative reverse transcriptasemediated PCR，qRT-PCR）验证（每组6只），引物由上海生因公司合成，使用β-肌动蛋白（β-actin）基因作为内部对照（引物序列见表1）。qRT-PCR方法按试剂盒说明书提供的方法进行，使用2-ΔΔCt法计算样品之间基因的相对表达水平。

1.7 生物信息学分析 为了推测补阳还五汤治疗脑梗死的作用机制，分别对模型组对比假手术组上调的基因和治疗组对比模型组表达下调的基因、模型组对比假手术组下调的基因和治疗组对比模型组表达上调的基因进行交集，得出补阳还五汤治疗脑梗死后逆转的差异表达基因，进一步对这部分基因进行生物信息学分析，包括基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。GO分析通过生物过程、细胞成分、分子功能3个方面来描述基因的功能；KEGG则通过对基因集合进行生物通路富集分析来预测生物学功能。

表1 验证的差异表达基因和内参的引物序列

1.8 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析。不符合正态分布的计量资料以M（P25～P75）表示，比较采用Kruskal-WallisH检验，总体比较以P＜0.05表示差异有统计学意义，进一步两两比较选用α分割法，以P＜0.017表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 补阳还五汤对小鼠脑梗死神经功能评分的影响 治疗前，与假手术组相比，模型组和治疗组小鼠mNSS升高，治疗组和模型组小鼠mNSS差异无统计学意义。MCAO术后7 d，治疗组小鼠mNSS评分低于模型组，差异有统计学意义（表2）。

2.2 补阳还五汤治疗小鼠脑梗死后逆转的差异基因表达谱 本研究通过高通量RNA-Seq分析获得治疗组、模型组和假手术组小鼠脑组织样品的差异基因的表达谱，各组间差异表达基因数如韦恩图（图1A）所示。模型组与假手术组相比，筛选得到1672个差异性表达的基因（1413个上调基因和259个下调基因）（图1B）；治疗组与模型组相比，筛选得到301个差异性表达的基因（110个上调基因和191个下调基因）（图1C）。

各组间差异表达基因的交集分析结果显示，模型组与假手术组相比上调且补阳还五汤治疗后下调的差异基因有134个，而模型组与假手术组相比下调且补阳还五汤治疗后上调的差异基因有19个。补阳还五汤逆转脑梗死后的差异基因的层次聚类分析结果见图2。

2.3 补阳还五汤治疗小鼠脑梗死后逆转的差异基因的验证 qRT-PCR验证结果显示，模型组小鼠脑梗死灶周Myd88、Map3k8、Lamc2、Il1r1、Tlr9基因的mRNA表达水平较假手术组明显升高，而补阳还五汤治疗后下降；模型组小鼠缺血脑组织中Cxcl10基因的mRNA表达水平较假手术组明显下调，而补阳还五汤治疗后明显上调（图3）。本研究qRT-PCR验证结果与RNA-Seq结果完全一致，证实本研究的高通量测序结果是准确和可靠的。

2.4 补阳还五汤治疗脑梗死小鼠后逆转的差异基因的GO分析 交集部分的差异基因的GO分析结果显示，脑梗死后显著上调且补阳还五汤治疗后显著下调的134个基因显著富集到508条GO条目，其中生物过程421条，细胞成分23条，分子功能64条。差异基因主要富集的前10个生物过程包括与炎症反应、免疫反应及细胞死亡密切相关的“对干扰素β反应、炎症反应的调节、T细胞介导的免疫调节、细胞杀伤、细胞因子介导的信号通路、中性粒细胞迁移、急性炎症反应、Myd88依赖性Toll样受体信号通路、参与细胞发育的程序性细胞死亡及自噬”；主要富集的前10个细胞成分包括主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类蛋白复合物、高尔基内侧池、内质网出口部位、吞噬囊泡、内吞囊泡、内质网膜的组成部分、溶酶体、细胞器膜的组成部分、基底膜及细胞器膜固有成分；主要富集的前10个分子功能条目包括CD8受体结合、β2-微球蛋白结合、Toll样受体结合、肽抗原结合、T细胞受体结合、免疫受体活性、碱性氨基酸跨膜转运蛋白活性、IL-1受体结合、细胞因子结合及生长因子受体结合（图4A）。

表2 治疗前和MCAO术后7 d三组小鼠神经功能评分比较

图1 治疗组、模型组和假手术组小鼠脑组织的差异表达基因

图2 治疗组、模型组和假手术组小鼠脑组织差异表达基因聚类图

脑梗死后显著下调且补阳还五汤治疗后显著上调的19个基因显著富集到202条GO条目，其中生物过程132条，细胞成分37条，分子功能33条。差异基因主要富集的前10个生物过程包括与神经可塑性有密切关系的“突触小泡中的神经递质负荷、锥体神经元分化、突触可塑性的正向调节、突触囊泡循环、神经递质运输、轴突引导、神经元投射引导、小泡介导的突触转运、细胞连接维持及神经元迁移的调节”；主要富集的前10个细胞成分包括兴奋性突触、突触前膜的组成部分、过氧物酶体、层粘连蛋白复合体、突触前膜、突触小泡、胞外囊泡、细胞投射膜、神经元胞体膜及运输囊泡；主要富集的前10个分子功能涉及神经肽Y受体活性、腺苷酸环化酶活性、L-谷氨酸跨膜转运蛋白活性、神经递质跨膜转运蛋白活性、蛋白磷酸酶2A结合、连接酶活性、血清素受体活性、阴离子跨膜转运活性、钠离子通道的活动及热激蛋白（heat shock protein，HSP）70结合（图4B）。

2.5 补阳还五汤治疗脑梗死小鼠后逆转的差异基因的KEGG分析 交集部分的差异基因的KEGG富集通路分析结果显示，脑梗死后上调且补阳还五汤治疗后下调的基因主要富集到抗原处理和呈递、Toll样受体信号通路、噬菌体、IL-17信号通路、补体和凝血级联、细胞衰老、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路和趋化因子信号通路等（图5A）；脑梗死后显著下调且补阳还五汤治疗后显著上调的基因主要富集到萜类主链生物合成、糖胺聚糖生物合成硫酸肝素/肝素、醛固酮调节钠重吸收、味觉传导、谷氨酸能突触、脂肪细胞脂肪分解的调节、长寿调节途径-多物种、长时程增强、逆行内源性大麻素信号转导和钙信号转导等信号通路（图5B）。

图3 补阳还五汤治疗脑梗死小鼠后逆转的差异表达基因的定量反转录PCR验证

图4 补阳还五汤治疗脑梗死小鼠后逆转的差异基因GO分析

图5 补阳还五汤治疗脑梗死小鼠后逆转的差异基因KEGG通路分析

3 讨论

补阳还五汤是治疗缺血性卒中气虚血瘀症的中药名方。研究证实，补阳还五汤治疗脑梗死患者效果好[8-9]，但其神经保护机制尚不完全清楚。

本研究采用高通量RNA-Seq技术发现，假手术组、模型组和治疗组小鼠脑组织的基因表达谱存在显著差异，qRT-PCR验证结果与RNA-Seq结果一致，炎症反应是急性脑缺血后组织损伤的重要机制之一。有研究表明，促炎细胞因子Myd88、Map3k8、IL1r1、Tlr9等在脑缺血后表达上调，介导炎症反应导致神经元死亡[10-14]。本研究结果显示，补阳还五汤降低了小鼠脑梗死灶周Myd88、Map3k8、IL1r1、Tlr9基因的mRNA表达水平，表明补阳还五汤可作用于多个分子靶点来减轻脑梗死后的神经炎症，这可能是其发挥神经保护作用的重要机制。

本研究进行了生物信息学分析，GO分析显示，小鼠脑梗死后显著上调且补阳还五汤治疗后下调的差异基因有134个，GO分析显示这些差异表达基因主要富集到急性炎症反应、免疫调节、细胞死亡等生物学过程，这些均为脑梗死后组织损伤的主要病理机制。KEGG分析表明，IL-17信号通路、Nod样受体信号通路、NF-κB信号通路等为差异表达基因主要富集的信号通路。文献报道，脑缺血可诱发IL-17表达上调，激活Nod样受体及NF-κB等炎症信号通路，促进炎症反应，导致神经细胞死亡[15-17]。由此，推测IL-17信号通路、Nod样受体信号通路及NF-κB信号通路等可能是补阳还五汤减轻小鼠脑梗死后脑组织损伤的潜在信号通路。

对小鼠脑梗死后下调且补阳还五汤治疗后上调的差异基因的GO分析显示，这些差异基因主要富集到锥体神经元分化、突触可塑性、神经递质运输等生物过程；与神经元、细胞投射膜及突触等细胞组分密切相关；参与神经肽Y受体的活性蛋白质、谷氨酸跨膜转运蛋白活性及神经递质转运活性等分子功能，这些生物功能对于脑梗死后神经结构修复和功能重塑是必不可少的。KEGG分析显示，补阳还五汤治疗后显著上调的基因显著富集到逆行内源性大麻素信号转导、长寿调节通路及长时程增强等信号通路。这些通路不仅参与脑损伤后神经可塑性的调节，而且对缺血脑组织具有抗炎和神经保护作用[18-19]。本研究结果提示，补阳还五汤治疗可能通过上调与神经重塑相关基因的表达水平，促进小鼠脑梗死后神经修复。

本研究表明，补阳还五汤可作用于与炎症反应和神经可塑性密切相关的多个分子靶点，减轻炎症导致的脑组织损伤并促进神经重塑，从而加快受损神经功能的修复。本研究为探讨补阳还五汤治疗急性脑梗死的作用机制提供了新的思路，不足之处是样本量不够大，同时通过生物信息分析得出的信号通路比较多，没有进一步研究补阳还五汤纠正炎症及促进神经重塑相关信号通路涉及的上游或下游相关受体及蛋白。