利用嫩叶外植体建立红腺忍冬组织快繁体系

杨 洋，黄旭龙，杨蕾蕾，Victor Amoroso，何韩军

(1.湖南医药学院药学院，湖南 怀化 418000；2.华南农业大学生命科学学院，广东 广州 510642；3.深圳市中国科学院仙湖植物园，广东 深圳 518004；4.College of Arts and Sciences,Central Mindanao University,Bukidnon 8710,Philippines)

红腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)藤本植物，又名菰腺忍冬、盘腺忍冬、山银花、大银花、大金银花、大叶金银花等，主产湖南、湖北、安徽等省，多生于山地、山谷的灌木丛、疏林中。红腺忍冬是《中华人民共和国药典》收录的中药山银花指定的原料之一[1]。其味甘、性寒，有清热解毒、凉散风热的功效，具有抗病原微生物、抗炎退热、抗氧化、抗肿瘤、抗过敏、抗动脉粥样硬化、降血脂、保护肝脏、免疫调节等药理作用[1-4]。红腺忍冬还被广泛应用于饮料、食品、保健品、化妆品、日用化工和畜牧兽医等领域。此外，红腺忍冬在园林观赏、绿化荒山、保持水土等方面亦具有重要的生态价值。

扦插和播种是红腺忍冬在生产中常用的繁殖方法，但扦插繁殖系数低，受季节限制并对扦插条要求高[5]，而播种苗抗旱性差，不利于作为种苗大规模推广[6]。利用组织培养对红腺忍冬优良株系进行快速繁殖，不仅繁殖速度快、繁殖系数高，还可以获得大量优良的脱毒种苗植株，拥有良好的应用前景。周婧等[7]和李魁鹏等[8]以红腺忍冬腋芽茎段为外植体进行组织培养，腋芽的萌发率分别为41.61%和53.3%，但腋芽的萌发率易受外植体取材季节的影响。缪剑华等[9]和师风华等[10]以无菌组培苗叶柄为外植体进行组织培养，不定根和不定芽的诱导率分别为62.50%和18.25%。赵元等[11]研究发现，大叶龙竹组培苗根系发达，造林成活率高、成林速度快、生长量大于传统育苗造林。Run-Ze Sun等[12]对旋蒴苣苔成熟叶片和幼嫩叶片的组培研究发现，成熟叶片中DNA去甲基化所需的DNA糖基化酶裂解酶的表达显著降低，故其再生能力随着外植体年龄的增加而降低。在广藿香[13]、金艳猕猴桃[14]、山葵[15]、福鼎大白茶[16]等诱导愈伤组织的研究中发现，以嫩叶为外植体优于老叶、顶芽、茎段及根。而不受季节影响且更易获取的嫩叶为外植体的红腺忍冬组培快繁体系尚未建立，愈伤组织的形成，芽的诱导分化的最适诱导培养基和条件尚待摸索。本研究以红腺忍冬嫩叶为外植体，旨在建立以红腺忍冬嫩叶为外植体的组织培养快速繁殖体系，为红腺忍冬种苗组织快繁工厂化大批量生产提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料为新鲜红腺忍冬嫩叶片，于2020年3月采自湖南省怀化市中方镇荆坪古村。

1.2 外植体消毒和愈伤组织的获得

选取红腺忍冬健康嫩叶为外植体，先用吐温80浸泡2 min，用自来水反复冲洗10 min，直至干净，然后在超净工作台上，用75%乙醇浸泡15 s，再用0.1% HgCl2处理3 min、8 min和15 min，无菌水反复振荡冲洗4～5次后置于接种盘中，将叶片接种于MS基本培养基上(图1 A)，按2,4-二氯苯氧乙酸(2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L)，设置12个培养基的植物生长调节剂浓度梯度和处理时间组合(表1)。每个处理接种10瓶，重复3次。每3 d观察一次，30 d后记录观察结果，并统计污染率、褐化死亡率和诱导率。

污染率(%)=(污染的外植体数/接种的外植体总数)×100%；

褐化死亡率(%)=(褐化死亡的外植体数/接种的外植体总数)×100%；

诱导率(%)=(诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体总数)×100%。

1.3 初代分化培养

在超净工作台上，取生长良好且长势一致的愈伤组织，用解剖刀切割成1 cm3左右大小后接种于以MS为基本培养基，设置6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA(0.01、0.05、0.10、0.50 mg/L)共16个处理组合(表2)。每3 d观察一次，30 d后统计愈伤组织诱导分化芽的出芽率及分化芽的生长情况。

出芽率(%)=(出芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数)×100%。

1.4 继代增殖培养

在超净工作台上，取生长良好且长势一致的分化芽，切割成大小和数目都相同的芽丛后接种到分别添加6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA(0.01、0.05、0.10 mg/L)的MS固体培养基中(表3)。每3 d观察一次，接种30 d后统计分化芽的增殖系数和生长状态。

增殖系数=增殖后芽的总数/接种时芽的总数。

1.5 生根培养

将生长至3～5 cm的芽自基部切下，接种至NAA(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L)的添加活性炭0.3 g/L的1/2 MS固体培养基中(表4)，以不添加活性炭为空白对照(ck)。每3 d观察一次，30 d后观察并统计组培苗生根的根长、根数及质量。

生根率(%)=(生根的诱导株数/接种的总株数)×100%。

表1 2,4-D浓度及HgCl2消毒时间对红腺忍冬诱导愈伤组织的影响Table 1 The effects of 2,4-D concentration and HgCl2 disinfection time on the callus induction of Lonicera hypoglauca Miq.

表2 不同6-BA和NAA浓度配比对愈伤组织诱导芽的影响Table 2 The impact by different content of 6-BA and NAA on buds induction of callus

1.6 炼苗及移栽

将生根培养瓶转移到炼苗室中培养2 d，拧松瓶盖1 d，打开瓶盖炼苗1 d，将苗取出，用流水轻轻冲洗干净根系间的培养基，然后移栽到营养土(V泥炭土∶V珍珠岩=3∶1)中，25 ℃下培养，定期浇水，每3 d观察一次，21 d后观察并统计幼苗成活率。

成活率(%)=(移栽成活的株数/移栽的总株数)×100%。

1.7 培养条件

本试验初代、继代培养基均为MS培养基，其中蔗糖30 g/L、琼脂7 g/L；生根培养基为1/2 MS培养基，蔗糖15 g/L、琼脂7 g/L、活性炭0.3 g/L。pH均调为5.8～6.0，121 KPa高压蒸汽灭菌20 min，培养温度为25 ℃，光照强度2 500 lx，光照时间12 h/d，相对湿度为60%。

2 结果与分析

2.1 红腺忍冬诱导愈伤组织培养的适宜条件筛选

以MS为基本培养基，研究不同浓度2,4-D及HgCl2不同消毒时间对红腺忍冬外植体诱导愈伤组织的影响。结果(表1、图1)表明，不同浓度2,4-D处理外植体均有不同程度的脱分化表现，而红腺忍冬外植体在A 7处理组合中，愈伤诱导率最高(86.67%)，且平均褐化死亡率最低(5.56%)，与其他11个组合相比具有显著差异，且长势好，颜色较绿，质地疏松(图1 B)。虽然A 9处理组合污染率最低，但综合处理8 min和15 min的污染率来看，两者相差不大，且8 min处理的褐化死亡率要显著低于15 min。因此，综合外植体平均诱导率、平均褐化死亡率和平均污染率，得出红腺忍冬嫩叶外植体最适消毒时间为8 min，最适诱导愈伤组织的生长调节剂2,4-D的浓度为4.0 mg/L。

2.2 愈伤组织分化培养

以MS为基本培养基，分别添加不同浓度6-BA和NAA。结果(表2)表明，随着6-BA浓度的升高，愈伤组织分化诱导芽的比率逐渐上升，当浓度超过1.0 mg/L后出芽率开始下降，NAA亦具有同样的变化趋势，说明高浓度的6-BA和NAA均不利于愈伤组织诱导分化芽。在16个处理组合中B 7的平均出芽率最高(83.33%)，且分化芽生长较粗壮，颜色鲜绿，长势最好。故6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L为本试验诱导愈伤组织分化较理想的生长调节剂配方。

2.3 分化芽的增殖培养

以MS为基本培养基，分别添加不同浓度6-BA和NAA。在9个试验处理组合中，红腺忍冬分化芽均有不同程度的增殖，且随着NAA浓度的缓慢升高，其分化芽增殖系数基本呈下降趋势，而随着6-BA浓度的不断增加，红腺忍冬分化芽增殖系数先增大后减小，当生长调节剂配比为6-BA 1.5 mg/L和NAA 0.05 mg/L时，红腺忍冬分化芽增殖系数最高(5.42)，且芽生长粗大，颜色较绿，长势好(图1 C)。适合红腺忍冬分化芽增殖诱导的生长调节剂配方为6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L。

注：A为接种的红腺忍冬外植体嫩叶； B为外植体诱导愈伤组织30 d生长情况；C为分化芽增殖30 d的生长情况； D为生根培养30 d生长情况；E为红腺忍冬炼苗移栽生长情况。图1 红腺忍冬的组织培养Fig.1 Tissue culture of Lonicera hypoglauca Miq.

表3 不同6-BA和NAA浓度配比对芽扩繁诱导的影响Table 3 The impact by different concentration ratios of 6-BA and NAA on shoot multiplication of buds

2.4 分化芽生根培养及炼苗移栽

将分化增殖的红腺忍冬芽切割成长3～5 cm，接种至不同浓度NAA的1/2 MS基本培养基中。结果(表4)显示，未添加活性炭的D 1～D 5组平均生根率明显低于添加了活性炭的D 6～D 10组，且D 6～D 10组根更粗壮，须根更多，生长状况也更好。在各组中，随着NAA浓度的增高，生根率呈先升后降的趋势，当NAA浓度为0.15 mg/L(D 3和D 8)时，生根率均达最大值，在D 8处理中高达91.11%，与其他浓度处理差异显著，且此时植株生长健康，根系粗壮发达(图1 D)，生长较快。因此，NAA 0.15 mg/L为诱导红腺忍冬生根的最适生长调节剂浓度。经过炼苗移栽至营养土(V泥炭土∶V珍珠岩=3∶1)中(图1 E)，25 ℃下培养，成活率高达100%。

3 讨 论

周婧等[7]和李魁鹏等[8]对红腺忍冬腋芽茎段进行消毒处理，污染率分别为34.64%和31.0%，Nong等[17]研究认为，红腺忍冬腋芽污染率相对较低(16.0%)。而本试验选用的红腺忍冬嫩叶为外植体的污染率仅为3.33%，污染率极低，能极大减少组培过程中由于污染造成的损失，提高组培效率和种苗供应量。此外，本研究的褐化死亡率也低于上述研究报道。再者，本研究发现，由于红腺忍冬嫩叶上着生有较多绒毛，在组织培养过程中如外植体消毒不彻底，会被污染甚至死亡，因此获得有活性的无菌材料是植物组织快繁体系建立的首要条件。相比于嫩叶，外植体腋芽除了被有绒毛以外，其整体结构更为复杂，一方面，由于叶原基和腋芽原基之间的缝隙容易藏菌；另一方面，相比于已经有部分成熟组织的嫩叶，腋芽的分生组织占比较大，对细菌、病毒的抗性相对较差，因此增加了细菌、病毒等在外植体上着生和感染的几率。张华通等[13]研究发现，以广藿香嫩叶作为外植体诱导率较高，污染率较低，而以顶芽和茎段做外植体的诱导过程中受到大量细菌和真菌的污染。吴燕燕等[14]发现，以金艳猕猴桃茎段做外植体比叶片更容易染菌。与老叶和茎段相比，福鼎大白茶嫩叶为外植体的褐化率最低，存活时间最长，且出现愈伤组织最早[16]。山葵嫩叶诱导愈伤组织诱导率(100%)高于老叶(90%)、叶柄(94%)、茎(38.67%)和根(41.33%)，且山葵嫩叶诱导的愈伤组织质地疏松，更易诱导分化出不定芽[15]。因此，以嫩叶为外植体不仅更优于其他部位，且不受季节限制，也更易获取，更适合工厂组织快繁大批量生产种苗的取材。

表4 不同NAA浓度对芽诱导生根的影响Table 4 The effects of different NAA concentrations on the roots regeneration of buds

外源生长调节剂的合理配比对红腺忍冬芽的诱导和增殖尤为关键。浓度过低或过高，都不利于芽的形成和增殖，过高浓度还有抑制作用。在分化芽的增殖试验中，本试验所得红腺忍冬分化芽增殖最佳生长调节剂配比为6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，这与李魁鹏等[8]、叶立涛等[18]和王慧俐等[19]利用腋芽和茎段为外植体研究获得的试验数据基本一致，但本试验的增殖系数(5.42)高于直接使用腋芽为外植体的Nong等[17]试验的增殖系数(1.50)和李魁鹏等[8]试验增殖系数(2.60)。结合本试验和相关文献，推测这可能是因为红腺忍冬嫩叶外植体经过脱分化和再分化的过程，已经适应了大量增殖的过程和环境，且形成了相对外植体腋芽更加无菌无病毒的分化芽，因此其分化增殖能力更强。

多项资料显示，由于山银花生命力旺盛等生理特征，因此其生根相对容易，加入适量浓度的NAA后，易长出须根，但浓度不宜太大，否则会阻遏根的生长，甚至导致植物枯死[18-20]。李翔[20]研究表明，山银花最适NAA生根浓度为0.25 mg/L。Nong等[17]研究显示，红腺忍冬生根培养较适宜NAA浓度为0.1 mg/L。缪剑华等[9]使用生长调节剂配比6-BA 2.0 mg/L+KT(呋喃氨基嘌呤)2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L得到最高生根率(62.50%)。在本研究中，当NAA浓度为0.15 mg/L时，生根率达到最大值(91.11%)，与Nong等[17]得到的数据较相近。在试验活性炭有无对比中发现，添加了适量(0.3 g/L)活性炭的根系和生长情况比没有添加活性炭时要好，不仅根须更多且相对粗壮，苗木也更健壮，叶色更浓绿，这可能除了活性炭吸附一些有害物质以外，还与组培苗根系有避光生长的特性有关[20]，添加活性炭后，为根系创造了生长的黑暗环境，故能更好地促进根系生长。

4 结 论

与其他外植体相比，利用嫩叶为外植体进行组培苗生产不仅更易获取大量材料，更有效降低了诱导愈伤组织和诱导芽产生的难度，获得更为健壮的再生植株，大大提高了红腺忍冬的繁殖效率。本研究首次以更易取材的红腺忍冬嫩叶为外植体，探索出一套较为完善的“外植体-愈伤组织-分化芽-增殖芽-分化根-炼苗移栽”的红腺忍冬组织快繁体系，为红腺忍冬种苗组织快繁工厂化大批量生产提供了新思路。