一种羊乳粉的微滴式数字PCR定量分析方法

陈 晨，史国华，张 瑞，张 涛，严陶陶，陈勃旭，张子仑，张 岩，周 巍,2,*

（1.河北省食品检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050071；2.河北师范大学生命科学学院，河北 石家庄 050024）

羊乳由于其营养成分中脂肪酸组成、含氮量、蛋白组成相比较于牛乳更贴近母乳[1-3]而被广大消费者喜爱，素有“奶中之王”的美誉。羊乳中不含牛乳中的αS1-酪蛋白、β-乳球蛋白等容易引起人体过敏的物质，更适合消费群体的需求，降低了易敏人群的致敏的风险。羊奶粉目前处于整体品类上升期，仍处于初级阶段，目前市场份额占比仅占乳品行业的4%，还有很大的发展空间，由于羊奶其独特的营养价值，越来越多的厂家进军羊奶粉市场，对牛奶粉形成了剧烈冲击，但奶羊的养殖区域的限制，奶羊上游产业仍需要较长时间才能建成，制约了羊奶粉产业的生长。市场上以牛乳冒充羊乳的商品欺诈现象时有发生，这不仅对市场造成影响，更因牛乳中含有易致敏的营养物质，增加了消费者的风险，严重危害了消费者的健康。

近几年，食品行业已经成为国民经济的支柱行业，食品安全事件也层出不穷，现在日益全球化的生产链使得食品掺假变得容易[4]，食品掺假不仅会让消费者丧失对市场监管部门的信任，还会对消费者的健康造成威胁，如出现痉挛、过敏甚至瘫痪现象[5-6]。目前市场上乳品的消费已经不再局限于新生儿的范畴，也是成年人及儿童重要营养物质的来源[7-8]。随着乳制品全球化的迅猛发展，一些生产商为降低生产成本，追求经济利益，在其中加入一些掺假物质，最为常见的为三聚氰胺，但假蛋白的加入会使掺假者面临查处的风险。为使得掺假产品达到真实的效果，生产商采用隐蔽性更强且同源的掺假形式，其中最为代表性的就是羊乳中加入牛乳降低成本[9-11]。目前鉴定乳源的方法有理化方法[12-15]、免疫技术[16-19]、基因方法[19-24]、蛋白检测[25-29]等，由于羊乳粉含量复杂，常用检测方法具有一定的局限性，数字聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）克服了传统方法操作复杂的弊端，更加准确地进行了定量检测。

数字PCR是现代新型的核酸绝对定量技术，是将其含有核酸模板的体系进行微滴化处理，进而进行PCR，反应结束后检测荧光信号进而分析出样品中核酸的浓度。该技术计算的是核酸的最原始的浓度，不再依赖标准曲线及标准品。Floren等[30]应用微滴式数字PCR技术对牛、马、猪源进行了定量检测。苗丽等[31]利用微滴式数字PCR技术建立了羊肉质量和拷贝数的关系。杨硕等[32]采用多重微滴式数字PCR完成了核桃露中核桃、大豆成分的物种定量鉴定。本研究建立了微滴式数字PCR技术对羊乳粉的定量检测方法研究，通过质量、DNA质量浓度、拷贝数，以DNA质量浓度为中间值，建立拷贝数与质量的关系式，再通过掺假模型进行实验方法的验证。以期为建立羊乳粉掺假的市场监管标准研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊乳粉购自陕西羊乳粉企业。

深加工食品DNA提取试剂盒（非离心柱型）天根生化科技（北京）有限公司；氯仿 北京酷来博科技有限公司；无水乙醇、异丙醇（均为分析纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；ddPCRTMSupermix for Probes（no dUTP）、Droplet Generation Oil for Probes、ddPCRTM Droplet Reader Oil 美国Bio-Rad公司。

1.2 仪器与设备

ME204/02电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器 常州润华电器有限公司；Sigma 3K15冷冻离心机 德国Sigma公司；NanoDrop 2000微量核酸蛋白测定仪 美国Thermo公司；LightCycler 480II实时荧光定量PCR仪 德国罗氏诊断有限公司；C1000 Touch Thermal Cycler PCR扩增仪、PCR Plate Sealer、QX200 Droplet Generator、QX200Droplet Reader、QX200 Droplet Generator、DG8 cartridge微滴生成卡、Holder微滴发生器 美国Bio-Rad公司；冰箱 青岛海尔股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因组DNA的提取

采用改良版的深加工食品DNA提取试剂盒，称取5～100 mg，加1 000 µL缓冲液GMO1和40 µL的蛋白酶K（20 mg/mL），涡旋振荡1 min。60 ℃孵育2 h。孵育过程中始终保持振荡。将孵育好的样本分别加入GMO2和三氯甲烷，加入量为200、400 µL，涡旋振荡1 min，静置10 min。在4 ℃、12 000 r/min离心5 min，转移上清液至新离心管中，并加入0.7 倍体积的异丙醇，充分混匀。在4 ℃、12 000 r/min离心3 min，去上清液留沉淀。加入700 µL 70%乙醇溶液，涡旋振荡5 s，在离心机上以12 000 r/min离心2 min，去除上清液。重复此步骤一次。开盖，在生物安全柜中，打开抽风放置20 min，彻底晾干残留乙醇。向其中加入洗脱缓冲液TE 30 µL，涡旋1 min，并测定DNA含量和纯度。

1.3.2 引物探针

由于羊乳粉存在物种间的差异性，选用针对绵羊和山羊都有效的特异性探针进行检测，引物和探针引用自[33]，见表1，结果显示该探针与其他物种间不存在交叉反应，特异性强，可应用于后续实验。

表1 羊引物探针Table 1 Sheep-specific primer and probe sequences

1.3.3 微滴式数字PCR

1.3.3.1 微滴式数字PCR反应条件

数字PCR反应条件包括2×ddPCR Super Mix为10 μL、上游引物用量为1.2 μL（10 μmol/L）、下游引物用量为1.2 μL（10 μmol/L）、探针用量为0.4 μL（10 μmol/L）、DNA模板为4.0 μL、ddH2O补齐20 μL体系。

反应程序为：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性1 min；56 ℃退火45 s；进行40个循环，98 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

1.3.3.2 微滴式数字PCR操作步骤

1）先将所需实验模板按一定梯度进行稀释，制成实验样品转移到微滴发生卡中，同时加入微滴发生油70 μL，进行微滴的制备。2）将制备好的微滴转移到96 孔板中，应用封膜仪进行封膜处理。3）将封好膜的96 孔板，放到C1000 Touch Thermal Cycler PCR扩增仪中扩增。4）扩增结束后将96 孔板放到QX200 Droplet Reader中，根据实际实验排版进行信息录入，读取实验结果，根据微滴发出的荧光信号的强度判定阳性和阴性结果，并记录下每个样品的阳性和阴性的微滴数。信号采集完毕后，软件Quantasoft将计算出最终结果并以图像形式给出。

1.3.4 特异性检测

微滴式数字PCR检测分别用羊乳粉、牛乳粉、骆驼乳粉、马乳粉、驴乳粉、猪、鸡、鸭、核桃、杏仁、花生、大豆的基因组DNA作为特异性检测的扩增对象，无菌双蒸水作为空白对照，每个样本设置两个平行。

1.3.5 质量与拷贝数关系曲线的建立

1.3.5.1 羊乳粉质量与提取DNA质量浓度的关系

称取羊乳粉10～180 mg不同质量的实验样本，进行不同质量实验样本的DNA提取，每个质量重复4次，减少实验误差，经Nanodrop 2000测定DNA的含量，从而建立质量和其DNA质量浓度之间的关系。

1.3.5.2 羊乳粉DNA质量浓度与数字PCR拷贝数关系的建立

将提取得到的羊乳粉基因组DNA进行系列稀释，稀释梯度为5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，每个梯度设置3个重复，为得到准确的拷贝数，需对其稀释的精确性有较高要求，以无菌双蒸水作为对照，通过进行微滴式数字PCR检测得到DNA含量和拷贝数的关系。

1.3.6 建立掺假模型及市售样本的检测

在羊乳粉掺假模型的建立中，羊乳粉为主要被掺假对象，构成掺假模型，掺假模型以100 mg为最大掺假质量进行设计，掺假比例为5∶95、10∶90、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20、100。之后将掺假的实验样本进行DNA的提取，并将提取好的基因组DNA进行10 倍稀释，取4 μL进行微滴式数字PCR的检测，得到的结果通过公式推算出实际值和测量值的差异，进而衡量所建立公式的准确性。

为进一步验证实验的准确性，本研究在市场上购买了一批标签显示为羊乳粉的商品进行测试，市售样本的测试均保证与实验样本操作过程一致，减小误差，每个样本设置3个平行。

1.4 数据分析

所有结果采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，利用Excel进行图表编辑。

2 结果与分析

2.1 特异性检测

基于微滴式数字PCR技术，选取羊乳粉、牛乳粉、骆驼乳粉、驴乳粉、马乳粉及猪、鸡、鸭、核桃、杏仁、花生、大豆的基因组DNA作为特异性检测对象，结果显示本实验羊的引物探针特异性良好，可应用于后续实验，具体实验结果见图1。

图1 羊乳粉特异性图谱Fig. 1 Specificity map of goat milk powder

2.2 提取质量、含量及拷贝数的关系曲线

为探索羊乳粉质量与DNA含量的关系，称取不同质量羊乳粉10～180 mg，对其进行基因组DNA提取，经测量得到不同质量梯度下的DNA质量浓度，进而得到质量浓度（y）与质量（x）的关系曲线，结果见表2，在称取的质量范围内质量与质量浓度呈良好的线性关系，y＝5.175 4x+3.839 4，R2＝0.992 7，说明实验结果具有一定的可信性。羊乳粉DNA质量浓度梯度图谱见图2。

表2 羊乳粉DNA提取结果Table 2 Results of DNA extraction from goat milk powder

图2 羊乳粉DNA质量浓度梯度图谱Fig. 2 DNA concentration gradient map from goat milk powder

统计学中规定变异系数小于15%，数据可靠。分析每个梯度各重复间羊乳粉DNA含量的最大变异系数为10.65%，所以数据具有可信性。将提取的基因组DNA分别稀释为5、10、20、40、60、80、100 ng/μL，取4 μL稀释后的DNA进行数字PCR检测，进行3次重复，结果见表3，取DNA拷贝数的平均值（y）与DNA质量浓度（x）进行线性拟合，y＝1.717 3x+2.149 3，R2＝0.998 1，结果显示两者的线性关系良好。

表3 羊乳粉DNA含量与拷贝数结果Table 3 DNA concentration and copy number from goat milk powder

2.3 质量与拷贝数公式的建立

根据2.2节曲线结果，以DNA含量为中间值进行换算时，DNA质量浓度先经过了10 倍稀释，再取4 μL进行计算，由此得到羊乳粉质量与DNA拷贝数之间的计算公式。M＝（C-4.75）/3.56，其中，M为羊乳粉质量（mg），C为DNA拷贝数（copies/μL）。

2.4 掺假模型的数字PCR检测

在羊乳粉掺假模型中，共设置7个不同的掺假比例，并对其样本进行基因组DNA的提取，并将提取的基因组DNA进行10 倍稀释，取4 μL进行上机实验，设置3个重复，并分析个各重复间的变异系数，并将拷贝数的平均值代入公式中进行计算得到目标物种的质量，统计学中规定变异系数小于15%，数据可靠，本掺假模型中变异系数最大为11.27%，所得结果均在统计学许可范围内。掺假模型的检测结果验证了本研究所建立的定量方法具有一定的准确性，可应用于市售羊乳粉的检测。具体结果见表4、图3。

表4 已知掺假比例的分析结果Table 4 Results of analysis of known adulteration levels

2.5 市售样本的数字PCR检测

在进行引物引用时考虑到了不同物种的羊的差异性，引证文献及本实验均进行了羊源性成分引物和探针的种内包容性和种间特异性，所以应用本实验建立的羊乳粉的微滴式数字PCR检测方法，对市场上标签为羊乳粉商品进行检测，市售羊乳粉的处理方法同掺假模型的方法一致，由表5可知，在检测的20 批次市售羊乳粉中，1 批次样本明显跟标签不符，标明是羊乳粉但实际检测羊乳粉含量为0，其他批次的样本中多少也存在一定的掺假现象。

表5 市售羊乳粉样本分析Table 5 Results of analysis of commercially available samples

3 结 论

采用微滴式数字PCR技术对羊乳粉进行掺假定量检测，通过羊乳粉的质量及其DNA含量，DNA含量及其扩增DNA拷贝数之间的线性拟合关系，得到羊乳粉质量和扩增DNA拷贝数的计算公式，从而可以快速鉴别羊乳粉的掺假情况。

为进一步验证方法的准确性，构建羊乳粉掺假模型，计算羊乳粉的实际掺入量，经扩增得到的实验值和实际加入的掺假质量相差不大，最大变异系数为11.27%，小于统计学中规定的15%的范围，且掺假模型中羊乳粉数据变异系数远小于规定值，说明数据具有一定的可靠性。

为验证本研究的市场应用价值，对羊乳粉市售样本进行微滴式数字PCR技术的检测。11 批次羊乳粉市售样本均存在掺假现象，结果表明市场上存在一定羊乳粉掺假，同时也证明该方法具有一定的实际应用能力。羊乳粉相对于牛乳粉来说，具有巨大的商业价值，羊乳粉适用人群广，价值高是现在受市场青睐的原因，实验结果表明，市场上存在为牟取不正当利益，利用牛乳粉充当羊乳粉的现象，从定量的角度进行掺假检测能更好地鉴别是人为掺假还是无意沾染，检测的结果能准确得知掺假的质量，进一步验证了该方法的准确性和实用性，能更加有利于市场监管部门的监管，为其提供技术支持。

综上所述，微滴式数字PCR技术能够准确进行羊乳粉的定量检测，这为市场上羊乳粉掺假定量问题提供了一种技术手段，同时本研究也为除羊乳粉之外的其他乳粉定量检测提供了一种检测方向，健全了定量检测体系。