基于代谢组学研究不同花色种类云南白茶的化学成分差异

王 哲，赵燕妮，陈 丹，彭佳堃，高健健，林 智，陈雪峰，田 军，万云龙，戴伟东,*

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西 西安 710021；2.农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；3.陕西农产品加工技术研究院，陕西 西安 710021；4.昆明七彩云南庆沣祥茶业股份有限公司，云南 昆明 650501）

白茶是我国特有的一种微发酵茶，属于六大茶类之一[1]。与其他茶类相比，白茶的加工工艺相对精简，仅包括萎凋和干燥两道工序。萎凋过程中，在茶叶多酚氧化酶和过氧化酶等内源酶的催化下，在制品发生轻微的发酵（氧化），促使其特殊代谢物积累，从而赋予白茶独特的香气与滋味品质以及特殊的药用价值和保健功效[2-4]。近年来，一些研究陆续阐明了白茶具有较好的生物活性和健康功效，包括抗氧化、抗突变、抗癌、保护神经细胞、保护小鼠肝脏和脑部组织免受急性氧化应激损伤等[5-9]，促进了白茶的消费市场和生产区域不断扩大。目前，白茶的产区主要集中于我国福建，近年来云南白茶产量快速增长，主要分布于云南临沧、景谷等地，据统计2018年景谷白茶产量已达145 t[10]。与福建白茶相类似，根据芽叶采摘嫩度的不同，云南白茶一般也可分为白毫银针（云白毫）、白牡丹（月光白）、寿眉（云寿）等花色种类。白毫银针（云白毫）以白毫密布为特点，由嫩梢的肥壮芽头制成；白牡丹（月光白）外形呈自然花朵形，显毫心，由嫩梢的一芽一、二叶制成，并可进一步分为月光白一级（由一芽一叶制成）和月光白二级（由一芽二叶制成）；寿眉（云寿）叶态较紧卷，色泽灰绿带褐，由一芽三四叶制成[11-12]。

近年来，已有较多研究对白茶的化学成分及生物活性进行了探究[13-14]，并解析福建白茶与云南白茶的化学成分差异[10,15]。在此之前，本课题组利用代谢组学方法对不同花色种类福建白茶的化学物质基础和滋味品质贡献成分进行研究[16]，但云南白茶化学成分方面的研究还相对较少。随着云南白茶产量不断增加，逐渐成为茶叶消费者的新宠，亟需开展不同花色种类云南白茶成分差异的研究。因此本研究采用超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole orbitrap mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap-MS）技术对云白毫、月光白一级、月光白二级、云寿四类云南白茶的化合物进行全面系统的解析，从“组学”的角度阐明不同花色种类云南白茶的代谢谱差异，从而为云南白茶的生产与消费提供化学成分方面的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从中国云南省临沧、普洱、大理、西双版纳等地采集具有代表性的白茶样品39个，其中包括云白毫10个，白牡丹分为月光白一级、月光白二级各10个，云寿9个，鲜叶嫩度分别为单芽、一芽一叶、一芽二叶、一芽三四叶（表1，样品由云南省茶叶流通协会提供）。鲜叶采集后利用室内萎凋槽进行萎凋，室温约20～26 ℃，相对湿度约60%～70%，萎凋约48 h后日光晒干；所用品种主要为云南大叶种（Camellia sinensisvar.assamica）；样品制作于2021年春季3～5月。在进行代谢组学分析前经过磨碎处理，置于-20 ℃冰箱贮存备用。

甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Merck公司；甲酸（99.0%，色谱纯） 日本TIC公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

儿茶素（catechin，C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、茶氨酸、脯氨酸、谷氨酸、牡荆素、异牡荆素、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素-3-芸香苷、山柰酚-3-芸香苷、山柰酚-3-半乳糖苷、山柰酚-3-葡萄糖苷等标准品 美国Sigma公司；聚酯型儿茶素A（theasinensin A）、聚酯型儿茶素F（theasinensin F）、原花青素B1（procyanidin B1）、原花青素B2（procyanidin B2）、茶黄素（theaflavin，TF）、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF-3-G）、茶黄素-3'-没食子酸酯（theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G）、茶黄素-3,3'-没食子酸酯（theaflavin-3,3'-digallate，TF-DG）等标准品 武汉ChemFaces公司。

表1 不同花色种类云南白茶样品信息Table 1 Information about the types of Yunnan white tea tested in this study

1.2 仪器与设备

UPLC-Q-Exactive/MS仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；S025粉碎研磨机 德国IKA公司；SQP电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DK-S11型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；5810R型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称量茶叶0.1 g置于15 mL离心管中，加入10 mL 70%甲醇溶液，充分溶解并置于70 ℃水浴锅浸提30 min，8 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，加超纯水稀释1 倍后进行UPLC-Q-Exactive/MS分析[17]。每个茶叶样品设置2个平行重复，同时将所有茶叶样品充分混合，制成QC样品，均匀地插入分析序列中，用于评价代谢组学过程的稳定性。

1.3.2 UPLC-MS分析条件

云南白茶样品代谢组学分析采用UPLC-Q-Exactive/MS系统进行数据采集。

UPLC条件：T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；流速0.4 mL/min；进样量3 μL。流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。洗脱程序：0～10 min，98%～85% A、2%～15% B；10～18 min，85%～60% A、15%～40% B；18～20.9 min，60%～10% A、40%～90% B；20.9～25 min，10%～98% A、90%～2% B。

四极杆轨道阱质谱条件：采用电喷雾离子源；检测模式：正离子模式；毛细管电压3.5 kV；毛细管温度300 ℃；辅助气温度和流速分别为350 ℃和10 L/min；质谱扫描范围m/z100～1 000。

1.3.3 主要化合物含量测定

参考课题组前期已建立的方法[17]，使用外标法对样品中儿茶素、茶氨酸、咖啡碱、黄酮糖苷类化合物进行含量测定。儿茶素类化合物采用表型儿茶素EGCG、ECG、EGC、EC标样进行定量；茶氨酸、咖啡碱、山柰酚-3-葡萄糖苷等分别使用对应标样进行定量。

1.4 数据处理

UPLC-Q-Exactive/MS分析得到的原始图谱采用Compound Discoverer 3.2软件进行峰匹配与峰面积提取。采用SIMCA-P 14.1（Umetrics，瑞典）进行有监督的偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和载荷图的绘制。采用SPSS 26（IBM，美国）进行单因素方差分析（ANOVA），用于筛选具有组间显著性差异的化合物。热图分析由Mev 4.7.4（Oracle，美国）完成。

2 结果与分析

2.1 基于UPLC-Q-Exactive/MS的不同花色种类云南白茶化学成分分析

经峰匹配与校准后共得到4 415个化合物离子用于后续的分析。通过与标准品比较、一级质谱、二级质谱分析等共鉴定出120个化合物，包括10个生物碱类、10个氨基酸类、5个有机酸类、11个酚酸类、5个香气糖苷类、10个儿茶素类、13个二聚儿茶素类、8个N-乙基-2-吡咯烷酮取代的儿茶素类（N-ethyl-2-pyrrolidinonesubstituted flavan-3-ols，EPSF）、25个黄酮糖苷类、10个脂质类及13个其他类化合物，具体信息见表2。

表2 不同花色种类云南白茶中鉴定出的化合物信息Table 2 Information about identified compounds in different types of Yunnan white tea

续表2

续表2

2.2 基于UPLC-Q-Exactive/MS的不同花色种类云南白茶化学成分差异分析

2.2.1 主成分分析

为评价不同花色种类云南白茶化学成分的差异，将得到的化合物离子导入SIMCA-P 14.1进行PLS-DA，如图1a所示，云白毫与云寿、月光白一级与月光白二级分别在第1主成分上具有显著的分离趋势；同时白牡丹（月光白一级、月光白二级）与云白毫、云寿在第2主成分上表现出显著的分离趋势，该结果充分表明云白毫、月光白一级、月光白二级、云寿的化学成分存在差异。VIP表示PLS-DA模型中每个化合物对差异做出的贡献值。VIP值越大，说明对PLS-DA模型的分类贡献越大，也表明该化合物在不同花色种类的云南白茶中含量存在较大差异；结合载荷图（图1b）发现部分化合物在云白毫和月光白一级中含量较高，分布在载荷图右侧；也有部分化合物在月光白二级和云寿中含量较高，分布在载荷图的左侧。

图1 不同花色种类云南白茶化学成分PLS-DAFig. 1 PLS-DA score plot (a) and loading plot (b) for chemical components of different types of Yunnan white tea

2.2.2 聚类分析

为进一步阐明不同花色种类云南白茶化学成分的具体差异，通过ANOVA单因素方差分析，从已鉴定的化合物中筛选出76个具有组间显著性差异的化合物（P＜0.05），涵盖了儿茶素类、二聚儿茶素类、生物碱类、黄酮糖苷类等多种化合物。进一步将76个显著差异化合物导入MeV4.7.4软件做热图聚类分析，结果如图2所示，图中黄色代表化合物相对含量高于平均值，蓝色代表化合物相对含量低于平均值。

2.2.3 儿茶素类化合物

儿茶素属于黄烷醇类化合物，是茶叶中最主要的多酚化合物，约占所有茶多酚含量的60%～80%。儿茶素因具有抗肿瘤、抗氧化、抗病菌以及保护心脑器官等多种药理作用而被广泛研究[16]。有研究表明白茶中的儿茶素含量高于红茶等发酵茶[18]。不同白茶中代表性差异化合物的含量变化如图3所示。在本研究中，EC、ECG、EGC和EGCG在云白毫中的含量较高，分别为3.87、33.82、8.50、48.53 mg/g；白牡丹次之，含量分别为3.11、29.52、4.74、31.49 mg/g；在云寿中含量最低，分别为3.04、24.97、3.60、21.72 mg/g，即儿茶素类化合物含量在嫩度较高的茶叶中含量较高，该结果与前期在福建白茶中的结果一致[16]。大多数儿茶素在新芽中的积累量高于在成熟叶中的积累量[19]；也有研究表明酯型儿茶素含量与鲜叶嫩度呈正相关[20]。此外，前期研究结果表明EGCG、ECG在白茶茶汤中的味道强度值大于1，是白茶滋味的主要贡献成分[16]。因此，具有较高儿茶素含量的云白毫可能具有较强的滋味浓度。相比之下，8-C-抗坏血酸没食子酸酯在月光白一级和云白毫中含量相对较高，表阿夫儿茶精在云寿中含量相对较高，这归因于儿茶素在特定组织中的积累和合成。

图2 不同花色种类云南白茶差异化合物含量热图Fig. 2 Heatmap analysis of differential compounds in different types of Yunnan white tea

2.2.4 二聚儿茶素类化合物

本研究中，鉴定出具有显著差异的二聚儿茶素类化合物共9个。在白茶萎凋过程中，经过多种酶的催化作用，茶叶内儿茶素类化合物发生一系列的聚合、缩合等反应逐步形成原花青素和聚酯型儿茶素等多种二聚儿茶素类产物[2,21]。原花青素是黄烷-3-醇的二聚体和低聚体产物，包括原花青素B1、原花青素B2、原花青素C1等，具有良好的抗氧化活性和清除羰基能力。有研究发现，未发酵绿茶中的原花青素含量最高，其次是轻微发酵的白茶和完全发酵的红茶，在萎凋和发酵过程中会导致花青素含量降低[18]。聚酯型儿茶素也是茶叶中儿茶素氧化产物的一种，包括聚酯型儿茶素A、聚酯型儿茶素B、聚酯型儿茶素C和聚酯型儿茶素F等，有研究表明聚酯型儿茶素的抗氧化活性优于EGCG和茶黄素[22]。本研究中，二聚儿茶素类化合物在不同花色种类的云南白茶中均表现出相同的变化趋势，即随着云南白茶原料嫩度的降低，含量逐渐降低。而前期在福建白茶的研究中[16]，由于不同的二聚儿茶素需要不同的儿茶素底物合成，故在不同花色种类的白茶中含量表现出不同的变化趋势，这可能是由于福建白茶与云南白茶的茶树品种不同以及生长气候条件差异造成。总体而言，二聚儿茶素类化合物均在云南白茶的云白毫中表现出较高的含量，这可能会赋予云白毫良好的抗氧化活性和清除自由基的能力。

2.2.5 生物碱类化合物

咖啡因和可可碱是甲基黄嘌呤生物碱，是茶叶中最主要的嘌呤生物碱和重要的苦味呈味物质，对茶叶的风味品质具有重要的贡献[23]。咖啡因在茶叶中的含量相对稳定，占茶叶干质量的1.5%～5%。在本研究中，咖啡因在云白毫和白牡丹中含量相对较高，分别为29.41 mg/g和29.02 mg/g，在云寿中含量相对较低，为24.57 mg/g。可可碱在云白毫中含量显著较高，约是在白牡丹中的2 倍，云寿中的4 倍。有研究表明茶叶叶片嫩度越高，咖啡碱含量越高，可可碱是咖啡碱合成的直接前体物质，因此在植物组织中的分布模式基本类似于咖啡碱，即新梢从上到下过程中，可可碱含量逐渐降低[24]。同时，本研究中还发现一些其他的生物碱类物质如磷酸胆碱、N-2-羟乙基-乳酰胺在云白毫和白牡丹中含量相对较高，云寿中含量相对较低；一些核苷酸类物质如腺嘌呤核糖核苷酸、5'-甲硫腺苷，在云白毫、月光白一级中含量相对较高，在月光白二级、云寿中含量相对较低。总体来说，生物碱类的化合物随着云南白茶原料嫩度的降低，含量呈降低趋势。

2.2.6 黄酮糖苷类化合物

黄酮糖苷是茶叶中重要的黄酮类化合物，具有良好的抗氧化活性，同时也是茶叶中重要的苦涩味成分，其味觉阈值较低且对咖啡碱的苦味有一定的增强作用[25]。黄酮糖苷按照苷元分类，可分为槲皮素苷、山柰酚苷、芹菜素苷和杨梅素苷[26]。在本研究中，鉴定出具有显著差异的黄酮糖苷类化合物共24个，其中芹菜素苷5个，包括牡荆素、异牡荆素、芹菜素-6,8-C-二葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖基-8-C-阿拉伯糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖基-8-C-葡萄糖苷，均在月光白二级和云寿中含量相对较高，在云白毫和月光白一级中含量相对较低；杨梅素苷2个，分别为杨梅素-3-半乳糖苷和杨梅素-3-葡萄糖苷，在白牡丹中含量相对较高，云寿次之，在云白毫中含量相对最低；山柰酚苷与槲皮素苷共16个，大部分均在云寿和白牡丹中表现出较高的含量，在云白毫中含量相对较低，例如山柰酚-3-半乳糖苷在云寿、白牡丹、云白毫中的含量分别为0.64、0.57、0.12 mg/g；山柰酚-3-芸香苷在云寿、白牡丹、云白毫中的含量分别为1.76、1.10、0.13 mg/g；槲皮素-3-葡萄糖苷在云寿、白牡丹、云白毫中的含量分别为0.74、0.56、0.06 mg/g；槲皮素-3-半乳糖苷在云寿、白牡丹、云白毫中的含量分别为2.16、1.91、0.45 mg/g。相比之下，2''-O-反式-对香豆酰紫云英苷、山柰酚-3-双香豆酰葡萄糖苷、山柰酚-3-香豆酰葡萄糖苷和山柰酚-3-(6-乙酰半乳糖苷)等酰基化的黄酮糖苷在云白毫中表现出较高的含量，白牡丹次之，云寿中最低。黄酮糖苷因为苷元的不同表现出不同的含量变化，芹菜素苷在月光白二级和云寿中含量较高，杨梅素苷在白牡丹中含量较高，大部分山柰酚苷和槲皮素苷在云寿中含量较高，整体来说绝大部分黄酮糖苷类化合物在云寿和白牡丹中的含量高于云白毫，与前期福建白茶的研究结果一致[16]。

2.2.7 氨基酸和脂质类化合物

氨基酸是茶叶中的主要化学成分之一，游离氨基酸含量约占茶叶干质量的1%～4%，赋予了茶叶一定的鲜味和香气，同时使茶汤呈现鲜爽醇和的特征。一般认为氨基酸含量较高的茶叶具有较好的风味品质[27-28]。有研究表明，白茶在长时间的萎凋过程中会导致蛋白质分解而产生较多的游离氨基酸[18]。茶氨酸是茶叶中独有的氨基酸，本研究中茶氨酸在云白毫中的含量最高，为18.10 mg/g，是在白牡丹中的1.15 倍，云寿中的1.23 倍；脯氨酸和亮氨酸在月光白一级中含量相对较高，月光白二级和云白毫次之，云寿中较低；苯丙氨酸在白牡丹中含量相对较高，云寿次之，在云白毫中含量相对较低；异亮氨酸在云寿中含量相对较高，白牡丹次之，在云白毫中含量相对较低。前期在福建白茶的研究中同样鉴定出以上氨基酸种类，并发现茶氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸含量与福建白茶的鲜味强度呈正相关[16]。另外，本研究中鉴定出具有显著差异的脂质共5个，包括甘油单酯（18:3）、溶血磷脂酰胆碱（18:3）、溶血磷脂酰胆碱（18:2）、溶血磷脂酰胆碱（18:1）和溶血磷脂酰胆碱（16:0），均在云寿中含量相对较高，白牡丹次之，云白毫中含量相对最低。有研究表明部分脂质与茶叶的鲜味呈正相关[29]，脂质与云南白茶的鲜味是否具有关联还需要进一步验证。

2.2.8 酚酸类化合物

酚酸是一类具有羧基和羟基的芳香族化合物，在茶叶口感上起着重要作用。有研究表明没食子酸会随着没食子酰化儿茶素的水解而积累[30]，与茶没食子素是绿茶饮料中的助鲜化合物，可以按比例增强L-谷氨酸钠的鲜味强度[31]。在本研究中茶没食子素、菊苣酸和对甲氧基水杨酸在云白毫中含量相对较高；双食子酰葡萄糖在月光白一级和云白毫中含量较高；而4-香豆酰奎宁酸和3-香豆酰奎宁酸在云寿和白牡丹中含量相对较高。这与前期福建白茶中的研究结果一致，此外统计分析表明没食子酸和4-香豆酰奎宁酸含量与福建白茶的苦涩味强度呈正相关[16]。

图3 不同花色种类云南白茶中代表性差异化合物的含量变化Fig. 3 Changes in contents of representative differential compounds among different types of Yunnan white tea

3 结 论

应用基于UPLC-Q-Exactive/MS的代谢组学方法对云白毫、月光白一级、月光白二级、云寿4 类云南白茶的化合物进行了系统分析，该方法准确全面地解析了不同花色种类云南白茶中120个化合物的含量差异，包括儿茶素类、二聚儿茶素类、氨基酸类、生物碱类、酚酸类、香气糖苷类、EPSF类、黄酮糖苷类、脂质类化合物等。通过PLS-DA模型发现不同花色种类云南白茶的化学成分存在显著差异，并通过ANOVA单因素方差分析筛选出具有组间显著性差异的化合物共76个（P＜0.05）。热图聚类分析结果显示，大部分儿茶素类（ECG、EGCG等）、二聚儿茶素类（原花青素、聚酯型儿茶素）、生物碱类（可可碱等）、茶氨酸、酚酸类（茶没食子素等）化合物随着云南白茶原料嫩度的降低，含量呈现下降趋势；这些化合物可能会赋予高等级云南白茶较好的滋味口感和良好的生物活性。大部分黄酮糖苷类化合物包括芹菜素苷（牡荆素等）、山柰酚苷（山柰酚-3-芸香苷等）、槲皮素苷（槲皮素-3-葡萄糖苷等）和脂质类（甘油单酯（18:3）等）化合物随着云南白茶原料嫩度的降低，含量呈现上升趋势；这些化合物可能会赋予低等级云南白茶较强的苦涩味。此外，部分氨基酸类化合物（亮氨酸等）、杨梅素苷（杨梅素-3-半乳糖苷、杨梅素-3-葡萄糖苷）等在白牡丹中呈现出相对较高的含量。本研究采用代谢组学方法较为系统全面地阐明了不同花色种类云南白茶的化学物质基础差异，为云南白茶的感官品质和营养价值的研究以及等级判别提供理论依据。