表观遗传修饰影响花青苷合成研究进展

张杨景晖，常沛瑶，杨紫淑，薛宇航，李雪奇，张旸

综 述

表观遗传修饰影响花青苷合成研究进展

张杨景晖，常沛瑶，杨紫淑，薛宇航，李雪奇，张旸

东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040

花青苷是广泛存在于植物中的一类重要的类黄酮化合物，对植物生长、代谢、应激等方面具有重要作用。在植物生长发育过程中，花青苷使植物的花和果实呈现出丰富色彩的颜色，从而吸引昆虫传粉和动物采食，便于结种和传播；在植物代谢应激反应中，花青苷使植物具有抵御低温、干旱、真菌感染，防御紫外线伤害、虫害等能力。花青苷生物合成通路受相关结构基因和转录因子的调控机制已被解析得十分清楚，近几年研究发现，植物花青苷生物合成相关基因受到表观调控，从而影响花青素苷的合成。表观遗传学是目前生命科学领域研究的热点之一，本文结合最新的植物花青苷合成表观遗传学研究进展，综述了花青苷合成过程中的表观遗传修饰以及基因编辑技术在表观遗传学研究中的应用，以期利用表观遗传手段为花色育种改良提供新思路。

花青苷；表观遗传修饰；CRISPR/dCas9

花青苷(anthocyanin)，又名花色素苷，属于黄酮类化合物，是花青素发生糖基化后形成的，使花青素能够稳定在植物细胞的液泡中。自然界中常见的花青素主要有6种：天竺葵色素、矢车菊色素、芍药色素、飞燕草色素、锦葵色素和矮牵牛色素[1]，是一类在植物中广泛存在的水溶性色素，能够赋予植物丰富的色彩，同时增强植物应对外界胁迫的能力。花青苷作为一类重要的植物次生代谢产物，其生物学功能包括抵御低温、干旱、真菌感染。花青苷的生物合成受结构基因和调节基因的共同调控，其中结构基因编码其生物合成途径中所需要的酶，调节基因参与调控结构基因的时空表达。花青苷合成结构基因的表达存在一定的协同效应，且结构基因的表达受MYB、bHLH和WD40这3类转录因子组成的MBW (MYB-bHLH-WD40) 转录复合体的调控[2]。近年来研究发现，另一类作用于基因表达水平上的调控——表观遗传调控与花青苷合成调控也有密切联系。

表观遗传学是指DNA核苷酸序列不发生变化而基因的表达发生了可遗传的改变。表观遗传修饰是指DNA与染色体上发生的一类与转录调控相关的修饰，可以诱发稳定的表型改变，在有丝分裂或减数分裂中遗传。近年来，多种植物的生命活动和表观遗传修饰的联系逐渐被发掘，从而揭示了环境因子和植物相互作用的复杂机制。

近年来随着花青苷生物合成表观遗传学调控机制研究的逐渐深入，有关花青苷的生物合成通路及转录因子调控花青苷生物合成的分子机制也在不断完善。目前的表观遗传研究已经证明多种表观遗传修饰类型调控植物花青苷的合成与积累。但是，表观修饰的类型包括哪些？表观修饰间如何联系？环境因素如何影响表观修饰？这些都是表观遗传学领域亟待回答的基本问题。本文总结了近几年表观遗传修饰影响花青苷合成的研究进展、存在的问题和发展前景，阐述了CRISPR/dCas9系统在植物表观遗传学研究中的应用及其在植物育种上的价值，以期为植物花色、果色育种开辟新途径。

1 花青苷合成的表观遗传修饰

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变，基因表达发生可遗传性变化的一门遗传学分支学科，其发生与很多生物学过程密切相关[3]，例如基因组印迹的DNA甲基化调控影响被子植物胚乳的正常发育和种子育性。表观遗传机制主要包括DNA甲基化、非编码RNA[4]、组蛋白修饰[5]、染色质重塑[6]和核小体定位[7]等。其中，表观修饰作用于DNA、组蛋白等参与基因表达的元件，从而对生物体内多种生命活动的基因表达产生调控。其中，植物花青苷合成是研究表观遗传调控生命活动的方向之一。

花青苷作为重要的植物次生代谢产物，在植物色彩呈现、应对胁迫等方面均具有重要作用。自20世纪90年代起，人们开始研究花青苷的合成机制以及花青苷的生物学功能，目前已较完整地解析了植物体内花青苷的生物合成通路[8]。由苯丙氨酸到花青苷的生物合成包括3个阶段：第一个阶段，由苯丙氨酸到香豆酰-辅酶A，该步骤受苯丙氨酸解氨酶基因调控；第二阶段，由香豆酰-辅酶A到二氢黄酮醇，其中查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,)是第一个关键基因，其催化产生后续反应的碳骨架查尔酮，然后在查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3 hydroxylase, F3H)、类黄酮-3′,5′-羟基化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)、类黄酮-3′-羟基化酶(flavonoid-3′-hydroxylase,F3′H)作用下合成三类二氢黄酮醇类物质：二氢槲皮素、二氢山奈酚、二氢杨梅素[9]。不同的二氢黄酮醇类物质在二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)催化下分别合成无色翠雀素、无色天竺葵色素、无色矢车菊素等无色花色素；第三阶段，无色花色素在不同花青苷合成酶(anthocyanin synthase, ANS)作用下加氧转变成有色的翠雀色素、天竺葵色素、矢车菊素，最后结合糖苷形成稳定的花青苷。

基于完整的花青苷合成通路，进一步发现了花青苷的合成调控因子，例如MYB-bHLH-WD40三元复合物(MBW)由R2R3-MYB转录因子(MYB75/PAP1、MYB90/PAP2、MYB113和MYB114)、bHLH转录因子(TT8、GL3和EGL3)和WD40蛋白TTG1组 成[10,11]，三者形成MBW复合物共同调控花青苷合成基因的表达。转录因子通过与花青苷合成基因启动子中的顺式作用元件结合，影响合成途径中的一个或多个关键酶基因的表达[12]，从而实现对花青苷合成途径的直接调控。基于已知的MBW复合物响应外界信号的相关研究进展，探索表观遗传修饰和花青苷合成之间的联系成为近几年的研究热点，包括花青苷合成基因和转录因子的表观修饰等。表观遗传修饰作用于启动子和特定DNA或组蛋白上，从而在转录水平上对花青苷的合成进行调控。Wang等[13]在萝卜(L.)中发现转座子在启动子甲基化修饰中发挥作用。这种可遗传的表观遗传变化是由于CACTA转座子的高甲基化，导致DNA甲基化扩散到花青苷调控因子的启动子区，降低了基因表达，抑制了白肉突变体花青苷的生物合成。Jia等[14]在草莓(×Duch. cv. Hongjia)和番茄(L. cv. Lichun)中发现组蛋白甲基化抑制花青苷的积累。在翻译后修饰中，Maier等[15]在拟南芥()中证明泛素化通过降解花青素合成蛋白(production of anthocyanin pigment, PAP)1和PAP2，从而调控花青苷的积累。目前，关于花青苷合成的表观遗传研究大致可分为以下几类：DNA甲基化修饰、组蛋白修饰、泛素化修饰、SUMO化修饰等。其中DNA甲基化修饰抑制基因表达，组蛋白修饰根据修饰位点和类型的不同抑制或促进基因表达，泛素化修饰通过降解转录因子抑制基因表达，而SUMO化则通过抑制泛素化作用稳定基因表达。具体如图1所示。

图1 表观修饰影响花青苷合成模型

A：DNA甲基化修饰(me)抑制花青苷合成基因表达。B：组蛋白修饰中，不同类型的修饰和同种类型不同程度的修饰会产生不同的效果。其中：①组蛋白抑制位点单甲基化修饰抑制花青苷合成基因表达；②某些赖氨酸位点(如H3K9me3、H3K27me3)的三甲基化修饰抑制花青苷合成基因表达；③某些赖氨酸位点(如H3K4me3、H3K36me3、H3K79me3)的三甲基化修饰促进花青苷合成基因表达；④组蛋白乙酰化修饰(ac)促进花青苷合成基因表达。C：泛素化修饰使转录因子降解从而抑制花青苷合成基因表达。D：SUMO化修饰使转录因子更稳定从而促进花青苷合成基因表达。

1.1 DNA甲基化与花青苷合成调控

1.1.1 DNA甲基化

DNA甲基化是指DNA序列中的胞嘧啶或腺嘌呤位点通过甲基转移酶作用共价结合甲基基团的一种修饰方式[16]，是表观遗传调控的重要组成。植物DNA甲基化通常指发生在DNA胞嘧啶第5位碳原子的甲基化修饰[17]，该过程与植物的生长发育调控密切相关[18]。根据植物基因组中胞嘧啶附近的序列组成，将甲基化分成CG、CHG和CHH三类(H指A、T、C中任意一种)。DNA在连接上一个小分子量且疏水的甲基后，通过改变染色质状态，使DNA与蛋白质等生命大分子活性物质的相互作用发生改变，直接影响基因表达。DNA甲基化是由甲基化和去甲基化反应动态调控的，其中甲基化过程包括DNA从头甲基化[19]和甲基化维持两种形成途径，该过程涉及多种甲基转移酶。DNA从头甲基化是由非编码RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)途径，在此途径中，SHH1 (Sawadee homeodomain homolog 1)招募RNA聚合酶IV (POL IV)等元件到基因组特定位点，并转录形成非编码RNA，在RNA依赖的聚合酶II(RDR2)作用下合成双链RNA(dsRNA)，并被DICER-LIKE PROTEIN 3 (DCL3)、DCL2和DCL4切割，产生24 nt小干扰RNA (small interfering RNAs, siRNAs)，siRNA与ARGONAUTE 4 (AGO 4)互补起支架作用的RNA结合，实现定位，使得与AGO4相互作用的甲基化酶DRM2 (domains rearranged methyltransferase 2)实现目标DNA甲基化[20]。而甲基化维持在拟南芥中主要的3种甲基转移酶包括MET1 (methyltransferase 1)维持CG甲基化、CMT3 (chromomethylase 3)维持CHG甲基化、DRM2维持CHH甲基化[21]。DNA去甲基化包括主动去甲基化和被动去甲基化两种途径。植物中DNA依赖4种去甲基化酶：ROS1 (repressor of silencing 1)、DME (Demeter)、DML2 (DME-like 2)和DML3[22]。DNA去甲基化酶主要通过主动去甲基化途径碱基切除修复机制来实现去甲基化，从而调控甲基化水平，并在此基础上通过调节蛋白介导去甲基化酶与特异位点之间的结合来进一步调节基因的表达与沉默[23]。当去甲基化酶无法实现功能时，被动去甲基化作为主要途径，由核因子NF粘附甲基化的DNA，使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化，从而阻断甲基化酶DNMT1 (DNA methyltrans­ferase 1)的作用，防止甲基化进行[24]。植物体内的总体甲基化水平通过甲基化和去甲基化动态过程控制，当植物面临生物胁迫和非生物胁迫时，基因组中DNA甲基化会发生改变，通过DNA甲基水平的传递实现表观性状的遗传性改变。

1.1.2 DNA甲基化与花青苷合成

DNA甲基化作为最常见的表观遗传修饰方式，在多数植物花青苷合成中起重要调控作用。Deng等[25]为探究荷花(Gaertn)的着色机制，对红白两个品种的花瓣进行甲基化水平分析，发现白色花瓣与高甲基化水平相偶联，但并未定位到具体区域甲基化和花青苷的联系。进一步研究发现DNA甲基化直接影响花青苷合成基因或调控因子的表达，从而影响花青苷的积累。Wang等[26]在梨()中发现基因启动子区甲基化抑制了花青苷的合成。Li[27]对苹果(Borkh)的研究也发现，花青苷合成正调控因子上游启动子区受到甲基化影响，基因表达受到抑制。通过测定苹果的甲基化组，发现苹果中CHH的甲基化类型占主导地位。也有研究尝试发现影响这些区域特异甲基化的因素，如环境因子是主要的影响因素。此外，Bai等[28]发现光照也是重要影响因子之一，通过遮光处理降低了基因上游区域甲基化水平并启动花青苷合成，显著提高非红苹果品种中色素含量。综上所述，DNA甲基化是花青苷合成表观调控中一种重要的修饰类型。然而，花青苷合成基因启动子区甲基化调控机制及如何精准调控仍知之甚少。

甲基化作为重要的表观遗传标记在花青苷合成中发挥重要作用。植物生命周期中积累的DNA甲基化作为表观遗传标记可以传递给下一代，为植物的遗传多样性提供了新的来源。植物基因组DNA甲基化状态会响应胁迫，植物可以调整相关基因的表达状态以应对胁迫，并且由胁迫引起的大多数DNA甲基化变异在世代间可稳定遗传。

1.2 组蛋白修饰与花青苷合成调控

1.2.1 组蛋白修饰

与DNA甲基化类似，组蛋白修饰也是重要的表观修饰方式。染色体的基本单位是核小体，核小体是由4对蛋白质H2A、H2B、H3、H4构成的八聚体结构及缠绕的DNA组成，并由连接蛋白H1固定[29]。这些缠绕着DNA的核小体经过复杂空间折叠形成染色质，染色质往往有两种存在形式，常染色质松散卷曲形态与基因表达有关，而异染色质紧密卷曲形式与基因沉默有关。组蛋白修饰存在于构成核小体的组蛋白八聚体的尾巴上，尤其是其氨基末端，在组蛋白修饰酶作用下发生各种甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化等翻译后修饰(histone post-translational modifications, PTMs)[30]。这些修饰通过影响组蛋白与DNA或与其他蛋白质结合的紧密程度，改变染色质致密或松散状态，从而促进或抑制相关基因的表达。组蛋白甲基化的动态调控依赖组蛋白甲基化转移酶HMTs (histone methyltransferases)、组蛋白甲基化识别蛋白(histone methylation recognition proteins)、组蛋白去甲基化酶(histone demethylases)三者的共同作用[31]。目前研究较多的修饰位点包括H3组蛋白上赖氨酸甲基化修饰H3K9、H3K27、H3K4、H3K36等。在组蛋白赖氨酸甲基转移酶KMTs的作用下，可产生3种甲基化产物[32]：组蛋白赖氨酸单甲基化，双甲基化和三甲基化。乙酰化和磷酸化是较为活跃的调控位点，相比甲基化通常是较为稳定的修饰方式。其中H3K4和H3K36通常被认为是活跃标记，代表染色质中活跃的转录区域；H3K9和H3K27甲基化通常被认为是抑制标记，代表染色质中基因沉默区域[33]。但这种标记并不是单一且绝对的，例如H3K9也可作为甲基化和乙酰化的竞争调控区域[29]。这些修饰作用于组蛋白，共同影响染色质状态，所以通常染色质是受到多种蛋白修饰[34]。乙酰化也是重要的修饰类型之一，与组蛋白甲基化类似，组蛋白乙酰化受组蛋白乙酰转移酶HATs (histone acetyltransferases)和组蛋白脱乙酰酶HDACs (histone deacetylase)动态平衡调控。拟南芥中编码的12种乙酰转移酶分为4大家族：CBP (CreB binding protein)、GNAT (Gcn5-related-N-termianl acetyltransferases)、MYST (MOZ，Ybf2/Sas3，Sas2，and Tip60-related)和TAF250 (TATA-binding protein- associated factor)；脱乙酰化蛋白可以被分为3大家族：RPD3/HDA1 (REDUCED POTASSIUM Dep­endence3/Histone deacetylase-1)、HD2 (plant-specific HD2- type HDACs)和SIR2(NAD-dependent Sirtuin-like HDACs)。一般来说，组蛋白乙酰化与基因活跃有关，而组蛋白去乙酰化抑制基因表达[35]。在这些修饰下，组蛋白电荷状态及染色质结构状态发生改变，通过改变染色质致密或松散状态，从而促进或抑制相关基因的表达。如乙酰化修饰可以通过不带电的乙酰基连接赖氨酸上带正电的氨基，中和组蛋白的赖氨酸残基携带的正电荷，使染色质有展开的趋势，促进基因表达。

1.2.2 组蛋白修饰与花青苷合成

组蛋白有H2A、H2B、H3、H4四种类型及其变体，组蛋白修饰通过改变组蛋白状态从而调控基因表达。组蛋白经过甲基化修饰后会使得染色质紧缩，抑制基因表达，组蛋白去甲基化酶则拮抗此过程。组蛋白甲基化效果也存在差异，如H3K9、H3K27和H4K20位点的甲基化抑制转录；组蛋白H3第4个赖氨酸位点的甲基化(H3K4me)和第36个赖氨酸位点的甲基化(H3K36me)影响转录延伸；组蛋白三甲基化(me3)根据不同的修饰位点实现基因激活或抑制，如H3K4me3、H3K36me3和H3K79me3促进转录，H3K9、H3K27抑制转录。Cai等[36]发现一个保守的组蛋白H2变异体H2A.Z可以影响其他组蛋白的修饰，该变异体通过对花青苷生物合成基因中的组蛋白H3第4个赖氨酸位点的三甲基化(H3K4me3)产生抑制作用，从而对花青苷生物合成基因的表达起到抑制作用。Fan等[37]在杨树(spp)转录本等的组蛋白去甲基化酶研究中，发现组蛋白H3K9去甲基酶JMJ25直接与一类负调控花青苷积累和原花青苷合成的转录因子基因结合，使染色质去甲基化，从而促进转录，减少了杨树花青苷的积累。组蛋白甲基化修饰与组蛋白去甲基化修饰对基因调控动态调控，共同调节基因表达。另外，广泛存在的组蛋白乙酰化可激活基因表达。在拟南芥中研究发现，组蛋白去乙酰化酶和花青苷合成存在联系。组蛋白去乙酰酶HDA19[38]和HAT1[39]通过减少靶基因组蛋白H3乙酰化，从而减少靶基因的表达，对花青苷晚期生物合成基因进行表观遗传调控。组蛋白修饰是表观遗传修饰中最复杂的修饰，其主要作用位点是组蛋白H3上的氨基酸位点。根据组蛋白修饰和花青苷合成的联系，可以人为调控组蛋白乙酰化促进花青苷合成基因表达，从而实现花色育种。通过dCas9系统，将相关的酶带到靶位点，改变组蛋白的修饰的状态，调控花色苷相关基因的表达来进行育种。

1.3 泛素化、SUMO化修饰与花青苷合成调控

1.3.1 泛素化、SUMO化修饰

表观遗传修饰除了经典的甲基化修饰和组蛋白修饰外，还包括泛素化、SUMO化、磷酸化等多种修饰类型，参与复杂的生命活动调控。例如在ATP存在情况下，蛋白质会依次在泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3作用下连接上泛素(ubiquitin)标记并被蛋白酶体识别，在蛋白酶体作用下，被标记的蛋白质将发生降解并导致DNA损伤修复等生物效应。另一种甲基化介导的蛋白翻译后修饰方式是类泛素蛋白修饰分子化(small ubiquitin- like modifier, SUMO)，这种修饰也依赖ATP供能，但与泛素化修饰不同的是，SUMO化修饰后蛋白质稳定性会增加。

1.3.2 泛素化、SUMO化修饰与花青苷合成

很多研究推测甲基化能够诱导下游其他修饰类型，如泛素化、SUMO化修饰等，形成复杂的调控网络。泛素化可以降解蛋白质，而SUMO化可以稳定蛋白质，二者共同调节蛋白质稳定性。花青苷作为植物中重要的次生代谢产物，通过靶向修饰调控关键转录因子的稳定性，从而影响花青苷的合成，以此来应对外界胁迫。首先，外界信号可作用于花青苷调控因子或者降解这些调控因子，从而实现对蛋白质的精确调控。如An等[40]发现苹果E3泛素连接酶MdMIEL1通过直接泛素化降解MdMYB308L转录因子，使得花青苷积累减少。其次，泛素化也可实现自身的反馈调控，维持自身蛋白质的稳定。Li等[41]发现在红色海棠(crabapplecv. ‘Royalty’)品种叶片发育过程中，花青苷合成调控因子McMYB10与特异性E3泛素连接酶基因和的启动子特异性结合，McMYB10通过促进McCOP1对McMYB10蛋白的泛素化，降解过多的McMYB10，间接影响下游花青苷合成，实现对花青苷积累的调控。

植物SUMO化修饰通过与受体赖氨酸残基竞争来拮抗泛素化。Zhou等[42]验证了MdMYB1潜在的互作蛋白MdSIZ1是一种SUMO E3连接酶，该酶介导的SUMO化抑制了泛素分子与花青苷相关的转录因子MdMYB1蛋白的偶联从而促进了MdMYB1蛋白的稳定性。此外，Zheng等[43]研究了在强光条件下表现出花青苷积累减少表型的拟南芥SUMO E3连接酶SIZ1(SAP and Miz1)和抑制拟南芥泛素化调控的关系，发现SUMO化修饰也是对强光胁迫的响应。目前研究者陆续发现了各类表观遗传修饰间相互关系，外界胁迫和花青苷合成的联系也可以通过修饰机制来解释，如泛素化修饰揭示环境因素和表观遗传调控联系。甲基化作为主要的表观修饰，与其他修饰存在间接联系，目前已经成为研究的主要出发点。

2 植物表观遗传学中CRISPR/dCas9相关研究应用

2.1 CRISPR/dCas9作用机制

基于以上各类表观遗传机制研究的需要，一类具有高效、便捷、精确特点的基因调控系统在表观遗传学研究中被广泛应用。在经典的成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)和Cas9蛋白(CRISPR-associated protein 9)组成的CRISPR/Cas9基因编辑系统中，Cas9蛋白是一类具有特异核酸酶剪切活性和核酸定位活性的蛋白[44]，其功能取决于两个结构域RuvC和HNH，HNH结构域切割与引导RNA序列互补的DNA链，而RuvC结构域通过sgRNA (single guide RNA)/Cas9复合体的Watson- Crick碱基对切割另一条非互补的DNA链。当RuvC和HNH同时处于失活状态时，形成dCas9(dead Cas9)只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能[45～47]。CRISPR/dCas9是一个强大的遗传操作工具，通过融合相关酶，将其带到DNA区域，对靶向DNA进行有效的基因修饰，满足表观遗传修饰研究的需求。CRISPR/dCas9是一种高效的表观遗传学研究工具。

2.2 CRISPR/dCas9在植物表观遗传修饰中的应用

2.2.1 CRISPR/dCas9在植物DNA甲基化和去甲基化中的应用

目前表观遗传学的相关报道中，CRISPR/dCas9系统在动物中主要用于揭示各类癌症和表观遗传修饰水平之间的联系，而CRISPR/dCas9系统在植物中应用很有限。CRISPR/dCas9系统在植物表观遗传的精准修饰，主要体现在DNA甲基化和组蛋白修饰两方面。其中该技术在甲基化修饰方面主要包括甲基化和去甲基化。Gallego-Bartolomé等[48]开发了基于CRISPR/dCas9的靶向去甲基化系统，利用去甲基化酶TET1催化结构域实现拟南芥基因组的靶向DNA去甲基化，证明了融合蛋白质标记系统SunTag的TET1催化结构域(TET1cd)与用于靶向启动子的dCas9和具有特异性的单链可变区片段scFv (single-chain fragment variable)模块间的融合可导致高效的靶向去甲基化，从而基因表达上调和获得可遗传的晚开花表型。通过进一步研究，Li等[49]利用CRISPR-dCas9-TET1靶向甲基化证明了甲基化mCG和mCHG是将RdDM机制作用于甲基化位点所需的记忆标记。尽管该系统非常便利，但需要表达外源TET1酶，因此，可能会对细胞代谢产生其他的影响。为了尽可能减少如去甲基化酶等外来成分的影响，调控原有去甲基化酶活性，Lu等[50]开发了一种新的CRISPR/dCas9-R2系统，利用CRISPR- dCas9将具有茎环结构的短RNA序列(称为R2)引入单向导RNA(sgRNA)支架位置，此时甲基化酶DNMT1被R2特异性招募，其酶活性在与R2结构结合时受到抑制，从而通过阻断靶基因座中甲基化酶DNMT1活性来降低DNA甲基化水平。此外，Ghoshal等[51]创制了基于CRISPR-dCas9的载体，使SunTag系统以序列特定的方式添加或移除植物中的特定靶位点DNA甲基化，并通过分析DNA甲基化数据，验证该结构的有效性和特异性。许多研究表明，转录因子结合DNA和DNA甲基化有关，表明表观遗传修饰影响基因的转录状态，基因的转录也会影响表观遗传修饰，但能否遗传还有待研究。在已知CRISPR/dCas9可以精确实现靶向DNA甲基化和去甲基化的基础上，可以针对花青苷合成基因的启动子区进行修饰，以提高花青苷在植物中的积累，从而为花色育种改良提供新思路。

2.2.2 CRISPR/dCas9在植物组蛋白修饰中的应用

组蛋白修饰种类众多，因此可利用CRISPR/dCas9连接不同的表观修饰酶进行精确修饰。Paixão等[52]通过将CRISPR/dCas9与组蛋白乙酰转移酶(AtHAT1)融合，激活拟南芥抗旱基因和(是正调控基因)的表达，使植株在水分亏缺条件下，表现出较高的叶绿素含量和较快的气孔开度，在干旱胁迫后具有较高的存活率。Chen等[53]建立了由dCas9/sgRNA-PP7和甲基化酶PCP- EZH2组成的基因修饰系统：在dCas9/sgRNA-PP7的指导下，PCP-EZH2可以特异性地靶向基因位点，催化组蛋白H3第27个赖氨酸位点的三甲基化(H3K27me3)，从而抑制基因表达，为基因表观遗传修饰提供了强有力的工具。组蛋白修饰的复杂机制还包括各种修饰间的相互作用。Zhao等[54]将CRISPR/dCas9的表观基因组编辑方法用于表观遗传机制间串扰的研究，揭示了H3K27ac和H3K4me3在基因激活过程中的关系。在CRISPR/dCas9的辅助下，组蛋白的靶向修饰更加精确，更加接近生物体内的真实情况。利用组蛋白乙酰化靶向激活花青苷合成基因的启动子区，在花色育种改良上提供了一种简便、高效的思路。

2.3 CRISPR/dCas9在花青苷合成中的应用

研究证明，花青苷合成过程受到表观遗传修饰调控，关键合成基因上的修饰通过酶、转录因子等的表达实现对花青苷合成和积累的调控。而CRISPR/ dCas9系统在此类研究中可以改变表观修饰水平，实现人为调控，便于揭示表观遗传修饰在花青苷合成中的调控机制。通过CRISPR/dCas9调控花青苷合成也进行了一些尝试。Selma等[55]利用可激活多个基因的dCasEV2.1，促进了烟草()关键花青苷合成基因的表达，并精确调控了代谢合成途径在黄烷醇、花青苷和黄烷酮分支流向，实现精准的控制上下游代谢，获得花青苷前体黄酮类物质，合成效率提升了4倍。Lowder等[56]利用dCas9融合VP64转录因子，使拟南芥控制花青苷合成的基因()启动子过表达，导致花青苷色素积累，使拟南芥的芽和根中形成紫色。而Park等[57]利用协同激活剂介质(synergistic activator mediator, SAM)系统策略，将最小的发夹适配体附着在sgRNA的四环和茎环2上来设计额外的sgRNA，并增加了NF-kappa B的p65反式激活亚基和热休克因子(HSF)融合dCas9实现基因的过表达及花青苷积累，使得叶子呈紫色。Ren等[58]在葡萄(L.)中利用dCas-VP64和dCas9-TV增强表达花青苷合成关键酶UDP-葡萄糖类黄酮糖基转移酶(UDP- glycose flavonoid glycosyltransferase, UFGT)，实现了花青苷表达量提升了1.6～5.6倍。同时，该研究也尝试利用多个sgRNA组合实现多个基因修饰，并且证明多个sgRNA的协同效果。

由于转录因子优先结合甲基化DNA，启动子招募的转录因子与其靶DNA序列结合可能会受到DNA甲基化等表观遗传修饰的干扰[59]，如DNA甲基化已被证明会破坏拟南芥中76%的转录因子与其靶DNA序列的结合[60]。为了防止表观修饰对植物自身的转录因子产生不利影响，增加sgRNA和dCas9的表达是提高CRISPR系统效率的一个重要策略[61]。在未来的植物花青苷合成研究中，有望将更多的表观遗传修饰相关酶应用到CRISPR/dCas9中，实现对花青苷合成酶基因的精准修饰，利用可遗传的基因调控手段创造高效合成花青苷的品种。此外，解码复杂的表观基因组也是育种的重要方向。CRISPR/dCas9能通过dCas9-CR融合对染色质动力学的局部扰动，了解目标位点染色质环境。如通过靶向组蛋白乙酰化打开位点的可及性，促进转录激活剂或抑制因子在不同位点的结合，导致不同的转录反应。CRISPR/dCas9凭借对局部染色质调控的优势，利于了解修饰间串扰和染色质重塑在发育中的作用。

CRISPR/dCas9技术自开发以来，在基因工程研究中的优势越来越明显。首先，CRISPR/dCas9能够适用几乎所有植物细胞的基因修饰研究，且操作简单、花费低，在普通实验室就可以使用。其次，与传统的转基因技术和组织特异启动子启动靶基因的特定表达等比较，该技术靶向特定DNA序列且仅需两个元件就可以运行。再次，与CRISPR/Cas9对调控基因启动子元件进行靶向编辑相比，该技术并不直接改变DNA序列，而是利用生物体自身的修饰酶，对DNA序列进行表观修饰。与其他传统的育种方法相比，CRISPR/dCas9表观修饰的方法具有高效、精准、可遗传等诸多优点。在此基础上，结合现有的多路复用设计等新策略和基因激活等其他方式，可以进一步优化该系统。综上所述，CRISPR/dCas9在花青苷合成的表观遗传学研究方向有着巨大的应用价值。

3 结语与展望

在花青苷合成代谢研究中尚有许多有待解决的问题，比如花青苷的修饰、转运和积累过程、花青苷转运基因的调控[62]等。在经典的合成通路基础上，花青苷合成的表观遗传修饰调控更为复杂，类型多样且相互关联，有待更深入的研究。例植物组蛋白H3K9me2标记和DNA甲基化这两种标记高度相关，体现表观修饰的复杂联系。此外，在花青苷合成调控机制上，如经典的MBW复合体中各成分也与表观遗传修饰有紧密联系，需要和酶合成代谢方式结合研究，体现花青苷合成的复杂性。目前，凭借新一代RNA干涉技术、转录组分析、甲基化组分析等技术，对花青苷合成通路中转录因子的表观修饰作用研究将会更透彻。

CRISPR/dCas9技术自发明以来，已用于多种生物的研究。与传统导入表观修饰酶等手段相比是高效的，可以快速、准确地定向改造植物特定性状。花青苷对植物生长和发育很重要。为了提高这些有用代谢物的产量，通常需要同时调节多个关键基因。例如(1)过表达关键基因，以确保前体的充足供应并增加目标通路的代谢通量；(2)沉默靶代谢物竞争途径中的关键酶基因，避免中间体被转移；(3)过表达转录因子，用于同时激活或抑制多个内源性关键基因，以增强代谢物的合成。利用CRISPR/dCas9系统连接修饰相关模块，实现对启动子等关键调控区域的精确修饰，可以提供一种利用酶修饰改变基因甲基化或乙酰化状态来进行育种改良的方法。

利用转基因技术将表观修饰元件导入目标植物内，进行目标性状花卉的资源育种是一个有发展前景的方向，而CRISPR/dCas9系统将凭借其精准定位功能，将对阐明花青苷的合成及其调控模式提供帮助，并为植物新品种的培育的改良提供支持。dCas9系统的应用需要全面选择酶模块、gRNA、选择表达系统等，靶基因的精确时空表达模式也是策略设计时需要考虑的关键参数，以便选择最合适的启动子进行dCas9系统的表达。

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Advances in epigenetic modification affecting anthocyanin synthesis

Yangjinghui Zhang, Peiyao Chang, Zishu Yang, Yuhang Xue, Xueqi Li, Yang Zhang

Anthocyanins are a class of important flavonoid compounds widely present in plants, and play important roles in plant growth, metabolism and stress responses. In the process of growth and development, anthocyanin renders the flowers and fruits of plants displaying rich colors, attracts insect pollination and animal feeding, thereby facilitating seed spreading and dissemination. In metabolic stress, anthocyanin can resist low temperature, drought, fungal infection, ultraviolet damage, insect pests and other stress-resistant processes. The anthocyanin biosynthesis is co-regulated by related structural genes as well as transcription factor genes. Recent studies have showed that the anthocyanin biosynthesis-related genes in plants are epigenetically regulated, thus affecting the synthesis of anthocyanin glycosides. Epigenetics is one of the hot topics in the field of biological sciences. In this review, we summarize the advances of epigenetic modifications in anthocyanin biosynthesis and the application of genome editing in epigenetics, thereby providing new ideas for flower color breeding improvement by epigenetic regulation.

anthocyanin; epigenetic modifications; CRISPR/dCas9

2022-05-24;

2022-08-24;

2022-09-26

国家重点研发计划项目(编号：2018YFD1000400)和黑龙江省自然科学基金联合引导项目(编号：LH2021C006)资助[Supported by the National Key R&D Program of China (No.2018YFD1000400) and the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province (No.LH2021C006)]

张杨景晖，在读本科生，专业方向：生物技术(基地班)。E-mail: 2019213077@nefu.edu.cn

张旸，博士，教授，研究方向：观赏植物表观遗传学。E-mail: summerzhang@126.com

10.16288/j.yczz.22-171

(责任编委: 储成才)