连作大豆根际促生菌的筛选鉴定及促生效果研究

冯晓硕，雷杰云，梁喜龙，栾晓燕，刘鑫磊，方淑梅

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.黑龙江省农业科学院大豆研究所）

连作障碍（Continuous cropping obstacles），也称为重茬或再植病害（（Replant disease），是指连续在同一地块土壤上栽培同种作物或近缘作物，即使正常管理也会出现作物生长发育不良、产量降低和品质下降的现象[1]。为减轻连作障碍的影响，种植者常采用施用化肥、农药等措施，不仅对生态环境造成破坏，并且过量施肥反而会引起连作障碍[2-4]。微生物肥料在抑制植物病原菌、促进作物生长、提高作物产量方面有亮眼表现，又复合生态农业的要求，日益得到科研人员的重视[5]。植物根际促生菌（plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR）是微生物肥料的研究热点。植物根际促生菌是根际土壤微生物群落结构的重要组成部分，具有加快土壤养分循环、促进植物对矿物营养的吸收的作用，还能分泌具有抑菌作用的次生代谢物、增强植物的抗病害能力[6-7]。因此，筛选优良的PGPR制成菌肥，既能抑制连作障碍促进作物生长，又不损害生态环境，一举多得。

研究从连作大豆的根际土中筛选出22株细菌，分别对其固氮、解磷、分泌植物生长素（IAA）、ACC脱氨酶活性以及发芽与苗期促生效果进行测定，旨在筛选出连作条件下优质、高效、促生效果明显的大豆根际促生菌，为下一步研制和开发应用可抵抗连作障碍的微生物菌肥奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土样

2019年9月于黑龙江大庆市林甸县试验基地采集连作多年的大豆根际土为样品，做好标记后装入无菌袋中保存，将样品于24 h内分离。或保存到4℃冰箱，48 h内分离。

1.1.2 主要培养基及试剂

LB培养基；NFM培养基；NBRIP培养基；PKO培养基，ADF培养基；刚果红液体培养基[8]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离纯化

菌株分离纯化用的是平板涂布法。取根际土壤悬液稀释涂布于LB平板，28℃培养3～4 d，挑取形态大小不同的菌落采用稀释平板划线进行纯化，纯化后加甘油-80℃保存备用。

1.2.2 菌株的鉴定

对菌株进行形态学鉴定，于光镜下观察菌体细胞形态；将菌种涂布在LB平板上，28℃培养，观察菌落形态。生理生化指标鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[9]。分子生物学鉴定送由生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2.3 菌株解磷能力测定

将在甘油管中保存的菌株，活化后点接种于NBRIP平板上，28℃恒温培养，第10天后观察、测量各菌株形成的溶磷圈大小。根据溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）比值（D/d）初步确定菌株溶磷能力进行定性测定。用钼锑抗比色法[10]测定有效磷增量，测定结果为3次重复值。

1.2.4 菌株分泌IAA能力测定

将菌株接入灭完菌的液体刚果红培养基内，以基础培养基（不接种菌株）为对照。置于28℃、130 r·min-1摇床培养12 d。离心后取上清液加入比色液置于暗处30 min后迅速用分光光度计比色（波长530 nm），标准曲线用纯3-吲哚乙酸制作[11]。测定结果为3次重复值。

1.2.5 菌株ACC脱氨酶酶活性的测定

分离菌株在LB培养液中过夜培养后4℃离心收集，以牛血清白蛋白为标准物做标准曲线，使用Bradford法[12]测定蛋白质含量。做3次平行试验，取平均值用于分析。ACC脱氨酶活力测定方法参照Bhusan H等[13-14]。

1.2.6 菌株固氮能力测定

将在甘油管中保存的菌株，活化后点接种于NFM平板上，28℃恒温培养5 d后观察菌株是否能在平板上生长。

1.2.7 菌株促生效果试验

将分离纯化保存的菌种活化后接种于50 mL LB液体培养基中，28℃，180 r·min-1培养24 h。将活化后不同菌种的菌液浓度调至OD600值为2.0。

种子萌发促生试验：将培养皿内铺两层滤纸，每个培养皿放置20粒饱满无损坏的大豆（东农豆252）。处理组加入4 mL不同菌液，以4 mL蒸馏水为对照。置于暗处培养，记录、拍照对比菌液是否对种子萌发有促生效果，每个处理3次重复。苗期促生试验：以灭菌蛭石作为栽培基质，将大豆盆栽置于25℃温室内培养25 d，每组设置10个重复。在各处理组植株根际加入2 mL菌液，空白培养液为对照。取大豆幼苗测量其形态指标[15]。

1.3 数据处理与分析

试验数据的处理与分析使用Excel与SPSS软件完成。

2 结果与分析

2.1 PGPR菌株的分离筛选

从连作大豆根际土壤中分离并初步筛选（固氮、溶磷）得到22株促生细菌。菌株编号分别为C22-1、C19、XC31、XC19、XC68、XC29、XC23、XC75、XC46、XC35、XC9、XC98、XC109、XC32、XC30、XC22、C27、XC78、XC82、XC45、XC118、XC26。

2.2 PGPR菌株的鉴定

2.2.1 形态学及生理生化鉴定

22株促生菌的形态学特征及部分生理生化指标的鉴定结果分别见表1、表2及图1、图2。菌株的细胞形态有粗杆状与近卵状2种。菌落颜色有白色与淡黄色两种。17株菌株12 h内可观察到生长，5株菌24 h内可观察到生长。

表1 22株PGPR菌株的形态学特征Table 1 Morphological characteristics of 22 PGPR strains

表2 22株PGPR菌株的部分生理生化指标Table 2 Some physiological and biochemical parameters of 22 PGPR strains

续表2 22株PGPR菌株的部分生理生化指标Continued table 2 Some physiological and biochemical parameters of 22 PGPR strains

图1 22株促生菌菌落形态图Fig.1 Colony morphology of 22 growth-promoting strains

图2 22株菌株革兰氏染色图Fig.2 Gram staining of 22 strains

2.3 菌株解磷、固氮能力测定结果

对22株PGPR菌株进行解磷能力的测定，结果如表4所示。其中，菌株XC22与XC46的解磷能力最强，D/d值分别为2.16和1.33，有效增磷量分别为17.49 mg·L-1和14.72 mg·L-1。菌株C22-1无解磷能力。各菌株产生溶磷透明圈结果如图3所示。

观察22株菌株在固氮培养基上的生长情况，22株菌株均能生长，其中菌株C22-1与XC98在培养基上生长状况最好（图4）。

2.4 产激素能力测定结果

2.4.1 菌株产IAA测定结果

对22株PGPR菌株的产生IAA测定结果如表3所示，22株菌株均有产生IAA的能力。其中产IAA能力最强的菌株为C27与XC98，分别为75.65 μg·mL-1和88.21 μg·mL-1。产IAA能力较弱的菌株为XC118与XC46，分别为17.97 μg·mL-1和17.72 μg·mL-1。

2.4.2 菌株ACC脱氨酶活性测定结果

对22株PGPR菌株的产生IAA测定结果如表3所示，22株菌株均有一定的ACC酶活性，但酶活性均不高。其中ACC脱氨酶活性最高的菌株是XC75，活性最低的菌株为C27，分别为0.67 U·mg-1和0.33 U·mg-1。

2.5 分子生物学鉴定

对分离筛选得到的22株PGPR菌株的16S rDNA序列通过NCBI数据库进行BLAST比对，完成分子生物学鉴定。结果如表4显示，菌株中分别归属于假单胞菌属（Pseudomonas），肠杆菌属（Enterobacter），土壤杆菌属（Agrobacterium），柠檬酸杆菌属（Citrobacter），沙雷氏菌属（Serratia），克雷伯氏菌属（Klebsiella），共6种菌属。其中，同属沙雷氏菌属（Serratia）的11株菌株（XC75、XC31、XC32、XC68、XC30、XC35、XC45、XC78、XC19、XC23、XC82）模 式菌株相同且相似度皆高于97%，菌落形态及生理生化性质相似，因此判定为相同菌株；同属柠檬酸杆菌属（Citrobacter）的2株菌株XC29、XC118模式菌株相同且相似度皆为99.86%且菌落形态及生理生化性质相似，判定为同一菌株。同属克雷伯氏菌属（Klebsiella）的2株菌株XC98、XC109模式菌株相同且相似度皆为99.86%1且菌落形态及生理生化性质相似，判定为同一菌株。最终得到10株不同菌株。用MEGA X构建的发育进化树（图3）。

图3 解磷培养基测定结果图Fig.3 Determination results of phosphorous solubilizing medium

表3 22株菌株的促生特性测定结果Table 3 Determination results of growth promoting characteristics of 22 strains

续表3 22株菌株的促生特性测定结果Continued table 3 Determination results of growth promoting characteristics of 22 strains

图4 菌株固氮能力测定结果图Fig.4 Results of determination of nitrogen fixation ability of strains

2.6 种子萌发及苗期促生结果

选取10株不同株菌株对大豆种子萌发的促生效果如图6所示。经XC45、XC26、C27、XC46，XC22、XC109、XC118菌液处理后的种子发芽率显著高于对照组种子发芽率，表明这7株菌株对大豆种子发芽有显著促进作用。其中经XC46菌液处理后种子发芽率最高，比对照组高48.3%。

表4 22株PGPR菌株的16S rDNA对比结果Table 4 Comparison results of 16S rDNA of 22 PGPR strains

图5 22株菌株基于16S rDNA的序列系统发育树Fig.5 Sequence phylogenetic tree of 22 strains based on 16S rDNA

10株菌株对大豆苗期的促生效果如表5所示。菌株XC118对株高促生效果最好；菌株XC26对茎粗促生效果最好；菌株XC22对根长促生效果最好；菌株XC22对根体积促生效果最好；菌株XC109、XC9对地上干重促生效果最好；菌株XC22、C22-1对地下干重促生效果最好。从综合来看，菌株XC22和C22-1的促生效果较好。XC22对各项（共6项）形态指标均有促生作用，C22-1对五项形态指标有促生作用。

图6 10株菌株对种子萌发的影响（P<0.05）Fig.6 Effects of 10 strains on seed germination（P<0.05）

表5 10株菌株对大豆苗期促生作用（P<0.05）Table 5 Effects of 10 strains on seedling growth promotion of soybean（P<0.05）

3 结论与讨论

连作障碍对大豆等油料作物危害极大，对大豆的产量、生理指标和病虫侵害都有不良影响。研究表明，一些PGPR通过产生植物生长调节物质对植物生长和产量产生有益的影响[16-22]。研究筛选出的22株PGPR菌中又21株具有溶磷能力，有效增磷量范围为0.19～17.49 mg·L-1；22株菌株具有固氮能力，其中2株菌株固氮能力较强；22株菌株均可分泌IAA，产量范围为17.72～88.21 μg·mL-1；22株菌株均具有ACC脱氨酶活性，酶活力范围为0.33～0.67 U·mg-1。与以往研究相比，筛选出的PGPR菌株溶磷能力较好，郭英等[23]从野生大豆根际促分离筛选出11株具有解磷促生菌，有效解磷量范围在2.87～57.31 mg·L-1。研究筛选出的PGPR菌株分泌IAA能力较好，刘长征等[24]从何首乌根际土壤中筛选出2株促生菌，IAA产量分别为38.65、33.64 μg·mL-1，张英等[25]从三叶草根际分离出10株具菌株的IAA产量范围在0.36～20.39 μg·mL-1。研究筛选出的PGPR菌株ACC脱氨酶活性较低，姬文秀等[26]从人参中筛出的产ACC脱氨酶内生细菌的酶比活力在0.2～10 U·mg-1之间，最高为9.73 U·mg-1，可能的原因是在连作逆境对促生菌的ACC酶活力有不良影响。总体来看，22株PGPR菌株中的溶磷能力和产IAA能力这两项促生特性较好，ACC脱氨酶能力较低。说明研究的22株PGPR菌株的溶磷和产IAA能力在连作大豆促生发挥的作用值得深入分析研究。

试验得到22株PGPR菌株，经鉴定分别属于6种菌属，通过菌落形态、理化性质及模式菌株对比后，判定为10株不同菌株，研究证明连作大豆根际细菌具有较丰富的种属多样性。秦士娇等[27]从黄瓜根际土壤中筛选出1株粘质沙雷氏菌，对黄瓜苗有显著的促生作用并且有良好的防病促生作用。在种子萌发与苗期试验中，XC46、XC22、C22-1对大豆的发芽和苗期生长都有很好的促生效果，且这3株促生菌株具有优良的固氮、分泌IAA和溶磷等特性，与促生试验结果相符合。分析结果说明：筛选出的这3株菌株可以作为优良的PGPR接种剂加以利用。研究结果可为后续PGPR微生物菌肥的研制与开发提供理论依据。

植物根际促生菌（PGPR）的应用是一种生态友好的化肥替代方法。因为它促进增产、消除了土壤带来的问题，并保持了生态系统的清洁[28-30]。目前的新的研究趋势是加入PGPR以促进植物发育。尽管迄今为止已经进行了大量的研究，但仍有许多难题需要解决，以促进PGPR的实际农业应用[31]。因此，需要制定适当的战略并进行更多的研究和试验。