携带OX40L重组溶瘤病毒的构建及靶向杀伤肝癌的研究*

杨 豪 邓卓雅 孙 芳 雷光林 程晋霞 于洪妤田崇瑜 张绍庚** 杨鹏辉**

（1）中国人民解放军总医院第五医学中心，北京 100039；2）河北北方学院，张家口 075000）

免疫疗法旨在改善机体免疫能力，刺激机体免疫系统，免疫制剂通过激活或增强机体的免疫系统，利用机体自身的免疫机制攻击癌细胞，促进机体对癌细胞的免疫应答，抑制癌组织生长［1-2］。免疫疗法是一种通过重塑免疫系统抑制肿瘤生长的治疗手段，主要分为主动免疫、被动免疫和联合免疫，包括检查点抑制剂、CAR-T疗法、溶瘤病毒、非特异性免疫调节剂等［3-4］。免疫疗法弥补了手术、传统放化疗在肿瘤治疗领域的局限性，在预防术后复发方面也发挥着积极作用。免疫疗法改变了肿瘤治疗方式，逐步成为极具潜力的临床治疗手段，被认为是治疗甚至治愈癌症最有前途的策略［5］。

溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）是一类重要的免疫治疗药物，可以是天然存在或基因工程技术设计的病毒［6］。研究表明，OVs可选择性感染肿瘤细胞，在肿瘤细胞内大量复制，最终裂解细胞，并释放大量的肿瘤抗原和新抗原，激活机体的免疫反应，抑制肿瘤生长［7-9］。溶瘤病毒具有选择性裂解肿瘤细胞、激活免疫系统的组合效应，使其成为潜在的原位肿瘤疫苗［10-11］。随着基因工程技术的进步，越来越多的研究人员将免疫检查点抑制剂嵌合在溶瘤病毒基因组序列上，构建重组溶瘤病毒，以优化靶向性，增强免疫原性。目前已有4款溶瘤病毒产品上市，用于恶性肿瘤的临床治疗［12-14］。溶瘤病毒疗法效果存在个体差异性，且治疗范围较为局限，尽管如此，溶瘤病毒疗法作为最有前途的免疫治疗方式，值得深入研究。

溶瘤病毒免疫治疗的最终目的是刺激机体免疫系统，激活T细胞，抑制肿瘤生长。T细胞的活化不仅由抗原刺激T细胞受体介导，也可由共刺激分子的共刺激信号介导，抗原与共刺激信号的结合能更好地激活T 细胞［15］。T 细胞表面表达的CD28 和抗原提呈细（APC）表面的CD80/CD86 是最著名的共刺激信号；肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族OX40（CD134）与其同源性配体OX40L（CD134L，CD252）结合参与T 细胞与APC 细胞的相互作用，也可为激活T细胞提供重要的共刺激信号［16-17］。在抗原呈递发生后，两种分子的表达增加，同时建立多种促炎因子信号通路，包括CD28连接，CD40L连接和干扰素γ 信号传导。它们的相互作用促进T细胞激活，增加效应细胞因子的产生并增强细胞迁移率［18］。研究表明，OX40-OX40L 相互作用可增强CD4+、CD8+T细胞功能，增强T细胞的抗肿瘤活性［19-20］。调节OX40-OX40L 通路可以影响体内肿瘤的发病机制，可作为治疗人类自身免疫性疾病的潜在靶点［21-22］。Porciuncula 等［23］研 究 发 现，OX40L能明显改善人非小细胞肺癌预后，Moderna公司基于OX40L的mRNA-2752免疫疗法，在治疗实体瘤和淋巴瘤患者的临床Ⅰ期试验显现了良好的抗肿瘤效果（clinicaltrials.gov）。本研究利用课题组前期成熟的流感病毒反向遗传学（reverse genetics，RG）技术，以A/PuertoRico/8/34（PR8）为骨架，将编码OX40L的基因片段嵌合在NS片段特定位置，成功拯救获得重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L，并通过体内外实验评价重组病毒靶向杀伤肝癌细胞的效果，有望为肝癌的临床免疫治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

质粒提取试剂盒、转染试剂盒购自德国QⅠAGEN 公司；反转录试剂盒购自全式金公司；UltraSYBR Mix 购自康为世纪； Trizol 购自Ⅰnvitrogen 公司；MTS 试剂盒购自美国Promega 公司；Annexin V-FⅠTC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；Brilliant Violet 510™anti-mouse CD3、 FⅠTC anti-mouse CD4、 PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a、APC anti-mouse CD45、PE antimouse CD69均购自美国Biolegend公司；小鼠淋巴细胞分离液购自达科为生物技术有限公司。

1.2 菌种与质粒

PR8流感病毒的8个骨架质粒（pHW191-PB2、pHW192-PB1、 pHW193-PA、 pHW194-HA、pHW195-NP、 pHW196-NA、 pHW197-M、pHW198-NS）均由本实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态购自TianGen公司；pHW2000载体质粒由本实验室提供。

1.3 细胞与病毒

非洲绿猴肾细胞COS Ⅰ 细胞、犬肾细胞MDCK均采购自中国科学院上海生命科学研究院；人正常肝细胞L02、人肝癌细胞HepG2、Huh7 均购自ATCC（American Type Culture Collection）细胞库；小鼠肝癌细胞H22由解放军总医院第五医学中心保存；流感病毒A/Puerto Rico/8/34（PR8）由本实验室保存。

1.4 实验动物

SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；4～6 周龄雌Balb/c 小鼠购自维通利华；所有动物实验均按照中国人民解放军总医院第五医学中心实验动物伦理委员会的指导方针进行。

1.5 重组质粒pFlu-OX40L-NS构建

在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Ⅰnformation，NCBⅠ）获得OX40L 基因序列，经文献调研及生物信息学预测分析，将OX40L 基因组开放阅读框序列经优化后插入流感病毒PR8 骨架质粒NS 基因第406 位点。重组序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。克隆入pHW2000 载体，并通过阳性克隆测序验证。

1.6 拯救重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L

将非洲绿猴肾细胞COSⅠ 细胞、犬肾细胞MDCK 在6 孔细胞板按2∶1 比例共培养，细胞数4×105个/孔。细胞长至单层约70%～80%，弃上清，PBS 洗3 次，换无抗无血清DMEM 培养基，按Effectene 转染试剂盒 （QⅠAGEN， Hilden，Germany）说明书转染。重组质粒pFlu-OX40L-NS与PR8 其余7个骨架质粒（pHW191-PB2、pHW192-PB1、 pHW193-PA、 pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M）均稀释至200 μg/L，各取1 μl 等量混匀，共转染COSⅠ /MDCK 细胞，37℃、5%CO2培养箱放置72 h 后，-80℃冰箱冻存。

1.7 鉴定重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L

1.7.1 血凝实验

转染后细胞反复冻融1 次后，接种9～11 日龄SPF 鸡胚，200 μl/枚，每个转染孔接种2 枚鸡胚，接种后蜡块封口，置37℃孵育箱孵育，72 h后4℃冰箱过夜。收取鸡胚尿囊液100 μl，倍比稀释后，用1%鸡红细胞测定血凝效价。

1.7.2 TCⅠD50测定

MDCK细胞铺96孔细胞板，细胞计数2×104/孔。细胞密度长至70%～80%，弃培养基，PBS 洗3 次。重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 依次按10-1、10-2、10-3、10-4……10-10倍比稀释后，接种MDCK细胞，5 d 后观察细胞状态，用1%鸡红细胞测定血凝效价。

1.7.3 RT-PCR鉴定

Trizol法提取重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L的RNA，反转录为cDNA 后，用甲型流感病毒NS 通用引物扩增。扩增产物跑琼脂糖凝胶电泳，用pHW198-NS 做对照。琼脂糖凝胶电泳鉴定后PCR产物送生工测序。

1.7.4 电镜观察重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L

重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 按1∶5 000 倍稀释，接种9～11日龄鸡胚，200 μl/枚。72 h后收取阳性鸡胚尿囊液，4 000 r/min离心25 min后，取上清经100 ku 膜包超滤，30%和60%的蔗糖梯度离心，32 000 r/min离心4 h，PBS脱糖，32 000 r/min离心2 h，获得纯化后rFlu-OX40L病毒，负染透射电镜观察其形态结构与大小分布。

1.8 体外评价重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L生物学活性

1.8.1 重组病毒在MDCK细胞的生长曲线

评价重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 体外复制能力，用无血清的DMEM按10-1、10-2、10-3、10-4……10-10倍比稀释后，接种MDCK 细胞，置于37℃、5% CO2培养箱，分别在12、24、48、72、96 h取上清液，测病毒滴度。

1.8.2 MTS细胞增殖实验

人正常肝细胞L02、人肝癌细胞HepG2 和Huh7 分别铺96 孔细胞板，细胞计数1×104/孔，细胞长至单层70%～80% 后，分别按感染复数（multiplicity of infection，MOI）0.1、1、3 接种，并设置阴性对照，于37℃、5% CO2培养24、48、72 h后，弃上清，PBS洗3次，加MTS试剂，37℃温箱避光孵育30 min 后，酶联免疫检测仪检测490 nm处吸光度值（A490）。

1.8.3 流式细胞术检测细胞死亡方式

L02、Huh7分别铺6孔细胞板，细胞长至单层70%～80%后，重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 按MOI值为1、3 感染细胞，并设置空白对照。感染48 h后，根据Annexin V-FⅠTC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.9 体内实验评价重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L溶瘤效果

1.9.1 肝癌荷瘤小鼠模型的建立

用4～6周龄雌性Balb/c小鼠，腹腔注射小鼠肝癌细胞H22，5～7 d后腹水形成，取腹水，3 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS 重悬，细胞计数5×106/只，于小鼠右侧腹股沟皮下接种。待瘤体长至80～120 mm3，随机分3 组（PBS 阴性对照组、PR8 阳性对照组、rFlu-OX40L 实验组），6 只/组，每隔1 d 瘤内分别接种PBS、PR8、重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L，连续接种7次，接种剂量分别为100 μl、3×105TCⅠD50/100 μl、3×106TCⅠD50/100 μl，每隔1 d测量小鼠肿瘤体积并观察小鼠生命体征。

1.9.2 病毒载量测定

MDCK细胞铺96孔细胞板，细胞计数2×104/孔。细胞密度长至70%～80%，弃培养基，PBS 洗3 次。取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、肿瘤组织至无血清DMEM 后研磨，12 000 r/min 离心1 min 后吸取上清，上清依次按10-1、10-2、10-3、10-4……10-10倍比稀释后，感染MDCK细胞，5 d后观察细胞状态，并用1%鸡红细胞测定上清液TCⅠD50。

1.9.3 流式细胞术检测淋巴细胞

取小鼠脾组织研磨过滤，滤液沿离心管管壁缓慢加入6 ml小鼠淋巴细胞分离液（达优），分离小鼠淋巴细胞，用含2% 胎牛血清的生理盐水（FACE 液） 配置抗体，每管样品分别加CD3、CD4、CD8、CD45、CD69 抗 体1 μl、FACE 液100 μl，充分混匀后4℃避光孵育30 min，FACE洗液洗去多余抗体，8 000 r/min离心1 min后弃上清，加入4%多聚甲醛200 μl/管，避光20 min后上流式细胞仪检测。

1.10 统计学分析

用统计软件GraphPad Prism 8.0 分析数据，采用单因素t检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组质粒pFlu-OX40L-NS的构建与鉴定

将OX40L 基因组开放阅读框序列552 bp，插入PR8 骨架质粒NS 序列，构建策略见图1a，大小为1 477 bp，克隆入pHW2000载体；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，重组质粒pFlu-OX40L-NS与pHW198-NS跑琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示，重组质粒片段大小与预期一致（图1b），表明重组质粒构建成功。

Fig.1 Construction and identification of recombiant plasmid pFlu-OX40L-NS

2.2 重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L的拯救及全面鉴定

重组质粒pFlu-OX40L-NS与PR8其余7个骨架质粒（pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、 pHW195-NP、 pHW196-NA、pHW197-M）等量混匀后，共转染COSⅠ /MDCK细胞（图2a），成功拯救重组溶瘤流感病毒，命名为rFlu-OX40L。重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L，第一代血凝效价25～26，经SPF 鸡胚稳定传代后，血凝效价可达27～28（图2b），病毒滴度达7～8 Lg(TCⅠD50/ml)（图2c）。

Fig.2 Stability of recombinant virus rFlu-OX40L

2.3 RT-PCR鉴定

Trizol法提取重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L的RNA，反转录为cDNA，用甲型流感病毒NS 通用引物扩增，扩增产物跑胶结果显示，重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 中NS 片段大小与重组质粒pFlu-OX40L-NS 大小一致（图3），PCR 产物送生工测序，测序结果与预期完全一致。

Fig.3 NS segment of rFlu-OX40L was identified with RT-PCR method

2.4 电镜观察重组病毒rFlu-OX40L形态

重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 经蔗糖浓度梯度纯化后，负染透射电镜观察，其形态呈球形，核衣壳表面有囊膜包裹，囊膜表面有纤毛（图4a），病毒颗粒大小分布在80～120 nm 之间（图4b），具有流感病毒典型的形态特征。

Fig.4 Morphology of recombinant oncolytic virus rFlu-OX40L under electron microscope(a)and size distribution of rFlu-OX40L virus(b)

2.5 重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L的生长曲线

重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 用无血清DMEM 按10-1、10-2、10-3、10-4……10-10倍比稀释后，感染MDCK 细胞，分别在24、48、72、96 h取上清测定血凝效价。结果显示，重组溶瘤流感病毒效价逐渐升高，72 h 时HA 效价达峰值为27，到96 h呈明显下降趋势（图5）。结果表明：重组溶瘤病毒株rFlu-OX40L与PR8毒株生长趋势相一致。

Fig.5 Growth kinetics of recombinant virus rFlu-OX40L

2.6 MTS检测重组病毒rFlu-OX40L对肝癌细胞活力的影响

人正常肝细胞L02、人肝癌细胞HepG2 和Huh7 分别铺96 孔板，重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L按MOI值为0.1、1、3感染细胞，并设置阴性对照，培养24、48、72 h 后加MTS 试剂，显色30 min后上机检测。结果显示，重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 可显著降低HepG2 和Huh7 的细胞活力，对正常肝细胞L02 无明显影响，且随时间延长、剂量增加，肝癌细胞活力明显降低，呈现时间和剂量依赖性（图6）。

2.7 流式细胞术检测重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L诱导细胞凋亡的效果

重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 按MOI值为1、3 分 别 感 染L02、HepG2 细 胞，48 h 后 按 照Annexin V-FⅠTC细胞凋亡检测试剂说明书操作，流式细胞仪检测细胞凋亡情况（图7）。结果显示，HepG2 细胞感染重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 凋亡率分别为10.91%、19.08%，对照组为8.46%（P＜0.001）。结果表明，重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 可诱导HepG2 细胞凋亡，并呈现剂量依赖性。

Fig.6 Cell viability of rFlu-OX40L virus on different hepatocyte cell lines were detected with MTS assay

Fig.7 Cell apoptosis induced by rFlu-OX40L virus were detected with flow cytometry

2.8 重组病毒rFlu-OX40L在动物体内的抑瘤效果

肝癌小鼠瘤体体积达80～120 mm3时，分别接种PBS、PR8 和rFlu-OX40L，每隔1 d 接种1 次，连续接种7次，每次接种前测量小鼠体积变化，最后一次接种7 d后，取小鼠肿瘤组织，称量肿瘤体积及重量；取小鼠肝、肺、肿瘤组织做病理切片；心、肝、脾、肺、肾、脑、肿瘤组织研磨后过滤，离心取上清，测量各组织病毒载量；小鼠脾组织研磨后流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、CD69+变化。结果显示：重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L组与PBS和PR8组相比，rFlu-OX40L组小鼠肿瘤体积变化明显比PBS 和PR8 组缓慢（图8a），处死小鼠，分离肿瘤组织，rFlu-OX40L组体积、重量明显小于PBS 和PR8 组（图8b～d）；PBS组小鼠各组织未检测到病毒；PR8组仅在肿瘤组织中检测到病毒，滴度为3～4 LgTCⅠD50/ml；重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 实验组仅在肿瘤组织中检测到病毒，滴度为7～8 LgTCⅠD50/ml，且实验组明显高于PR8对照组（图8e）；实验组小鼠的脾组织经流式细胞术检测可见CD4+CD69+T 达34.4%、CD8+CD69+T 达33.5%，与PR8、PBS 组相比明显升高（图8f）。结果表明，重组溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 可显著抑制小鼠肿瘤生长，在肿瘤部位可检测到较高病毒载量，且小鼠脾脏T细胞数量显著增加，推测重组病毒rFlu-OX40L 可激活T细胞，从而靶向杀伤肿瘤细胞发挥抑瘤效果。

Fig.8 Oncolytic effect of rflu-OX40L was evaluated in vivo

3 讨 论

OX40L 是TNF 超家族成员，是一种由多种免疫细胞和非免疫细胞表达的共刺激分子，已被证明其参与T细胞活化，增强T细胞的抗肿瘤活性［24］。OX40L 信号对于成熟的CD4+T 细胞活化和CD4+记忆T细胞的产生至关重要［25］。活化CD4+T细胞上OX40L，对建立有效的T 细胞免疫具有辅助作用，能有效增强免疫系统对抗癌症［26］。OX40 和OX40 配体（OX40L） 作为必需的免疫检查点（ⅠC）调节剂，与癌症免疫调节以及肿瘤微环境（TME）高度相关［27］。利用OX40L 这一特性，研究人员尝试将OX40L 作为肿瘤治疗的靶点，与不同的抗癌药物结合，增强机体免疫，抑制肿瘤生长。

本课题组前期构建了成熟的流感病毒8质粒病毒拯救技术平台，成功拯救了嵌合GM-CSF、CTLA4 抗体的多株重组溶瘤流感病毒株［28-29］。利用这一技术平台，将OX40L 基因组序列，构建在PR8流感病毒株的NS片段上，克隆入pHW2000载体，通过阳性克隆验证其片段大小与预期一致。利用RG 技术成功拯救的重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L，可在鸡胚连续稳定传代，HA 效价达27～28，病毒滴度达7～8 LgTCⅠD50/ml；重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 的NS 片段经RT-PCR 鉴定，片段大小与预期一致；电镜观察重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 呈球型，大小在80～120 nm 之间，形态结构与流感病毒典型特征相符；重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 在MDCK 细胞上72 h 达到病毒复制高峰；MTS 法与传统的MTT 法相比，具有操作简单、灵敏度高、节省时间的优势，因此选用MTS 法检测重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 对细胞活力的影响，结果表明rFlu-OX40L 对正常的肝细胞没有影响，但可显著抑制肝癌细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果与MTS 法检测一致，表明重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 可选择性杀伤肝癌细胞，而对正常细胞无明显影响，且3MOI时效果更加显著；肝癌荷瘤小鼠模型瘤内注射重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 后，小鼠肿瘤体积明显比PR8组、PBS组增长缓慢；重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 组中小鼠肿瘤组织病毒载量明显高于其他组织；流式细胞术检测重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L组小鼠脾组织中CD4+CD69+T、CD8+CD69+T 细胞明显高于PR8、PBS 组，推测重组病毒rFlu-OX40L 可通过激活机体T 细胞免疫应答反应，靶向杀伤肿瘤细胞实现抗肿瘤作用。

本研究仍存在诸多不足，如重组溶瘤病毒rFlu-OX40L 在体内的安全性评价（急性毒性、过敏、热源、长期毒性等），对其他实体肿瘤（肺癌、乳腺癌等）是否具有广谱杀伤效果，以及如何确定最佳给药剂量、给药间隔、给药途径等以达到最佳的抗肿瘤效果等问题，仍需后续深入研究不断完善。

综上所述，本研究基于流感病毒RG技术，成功构建、拯救了携带OX40L 外源基因的重组溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L，体内外实验验证了其靶向杀伤肝癌细胞的效果，有望为肿瘤的免疫治疗提供理论依据。那么，携带OX40L 的重组流感病毒rFlu-OX40L 能否与其他免疫治疗药物联合应用发挥协同作用？携带多种靶基因的重组流感病毒能否起到更强的抗肿瘤免疫效果？这些研究工作还有待后续进一步探索。

4 结 论

本研究利用基因工程技术成功构建了嵌合OX40L的重组NS质粒，并成功拯救了表达OX40L的重组溶瘤流感病毒，经体内外实验验证了其靶向杀伤肝癌细胞的能力。