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细菌分泌系统的结构及作用机制研究进展*

2022-12-22张昭寰黄振华潘迎捷

生物化学与生物物理进展 2022年12期
关键词:底物复合物结构域

刘 静 张昭寰** 吴 倩 陶 倩 黄振华 潘迎捷 赵 勇**

(1)上海海洋大学食品学院,上海 201306;2)农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海 201306;3)上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)

蛋白质分泌是细菌最基本的功能之一,在细菌发挥致病性、适应环境、生存及繁殖等生理过程中起着关键作用[1]。分泌系统是细菌体内一类结构复杂的跨膜蛋白质机器,负责相关蛋白质的合成、转运及胞外分泌[2]。目前已经确定了9种分泌系统(图1):按发现时间顺序,分别命名为第Ⅰ型到第ⅠX型分泌系统(T1SS~T9SS)。这些分泌系统依据其转运机制可被分为一步分泌和两步分泌[3]:一步分泌系统不需要依赖Sec等通用分泌途径,可直接将底物从细胞质运输到细胞外环境或进入靶细胞,主要包括Ⅰ型(T1SS)、ⅠⅠⅠ型(T3SS)、ⅠV 型(T4SS)、VⅠ型分泌系统(T6SS)和Ⅶ型分泌系统(T7SS);而在两步分泌系统中,底物首先通过内膜跨越转运体(如SecYEG转位蛋白或双精氨酸易位Tat 系统)转运到周质空间,然后通过专门的外膜分泌系统分泌到细胞外空间,包括ⅠⅠ型(T2SS)、V 型(T5SS)、VⅠⅠⅠ型分泌系统(T8SS)以及ⅠX 型分泌系统(T9SS)。明晰这些分泌系统具体的三维结构,能够使人们在原子水平上更好地理解其生命调控机制[4],有助于细菌的多元利用和有效控制[5]。

近年来, 随着X 射线晶体学(X-ray crystallography)、核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)及冷冻电镜(cryo-electron microscopy,Cryo-EM)等结构生物学技术的发展与应用[6],细菌分泌系统结构及分子机制的研究取得了长足进展[7],对此类研究进行全面系统的综述,有助于对分泌系统跨膜转运机制的理解和认知。在国际上,2015年,Costa等[7]对T1SS~T6SS的主要结构和分泌机制进行了综述。2020年,Umrekar 等[8]基于Cryo-EM 解析的T2SS、T3SS、T4SS 以及T6SS 部分复合物的具体结构进行了综述。国内也有类似的综述报道,2009年谭双等[9]对T1SS~T5SS进行了综述。2019年,岑雪等[10]简要介绍了细菌的9 种分泌系统。2016年,本课题组[11]也对副溶血性弧菌T3SS和T6SS进行了综述。但是,以上这些综述多聚焦于分泌系统的功能,缺乏具体结构的深入介绍,而且部分综述仅针对个别系统进行总结,关于细菌分泌系统全面详尽的综述亟待开展。

Fig.1 Illustration of bacterial secretion system图1 细菌分泌系统示意图

因此,本文结合近年来围绕细菌T1SS~T9SS的研究,对各分泌系统的结构信息进行了系统整合(表1),总结了这些分泌系统的分子作用机制,并对其未来的发展方向进行了展望,以期为与细菌蛋白质分泌相关的致病、耐药、环境适应性等机制的研究奠定理论基础,为进一步开发以分泌系统结构为基础的小分子抑菌物质提供精准的三维靶标。

Table 1 The key structural features of bacterial secretion systems表1 细菌分泌系统关键结构特征

续表1

1 I型分泌系统(type I secretion system,T1SS)

T1SS 是一种广泛存在于革兰氏阴性菌细胞膜上的蛋白质分泌装置,介导多种底物从细胞质一步分泌到细胞外环境,通常与营养获取和毒力有关[12]。 研 究 表 明, 该 系 统 与 多 药 外 排 泵(resistance-nodulation-cell division,RND)家族的结构组成密切相关[13],主要由内膜蛋白(inner membrane component,ⅠMC)、周 质 膜 融 合 蛋 白(membrane-fusion protein,MFP) 和外膜孔蛋白(outer-membrane porin,OMP)组成,这3个组分组装成1个跨越内膜和外膜的复合体,为底物提供一条跨膜转运的通道(图2a)。

1.1 内膜蛋白(IMC)

在T1SS 中,ⅠMC主要属于ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC transporter)家族,能够利用ATP水解产生的能量,将结合的底物从细胞质通过内膜转移到MFP 的周质腔[12]。ABC转运蛋白的最小功能单元由2个核苷酸结合域(nucleotide-binding domains,NBDs)和2个跨膜结合域(transmembrane binding domains,TMDs)组成(图2a)。2个TMD结合形成底物识别位点和底物易位路径,NBDs 则通过结合和水解2个ATP 分子为底物的运输提供动力。

2003年,Schmitt等[43]采用X射线晶体解析技术,首次解析了大肠杆菌(Escherichia coli)运输α 溶血素T1SS 内膜蛋白HlyB 的NBD 结构域(图2b),其主要由2个结构域构成。第1个结构域(图2b橙色)由2个β片层和α螺旋组成,第1个β片层由4条反平行β折叠(S1~S4)组成,第2个β片层由6 条平行β 折叠(S3,S8~S12)组成,9 号β 折叠N 端相邻的Pro-loop 与NBD 的热稳定性和表达量密切相关。α 螺旋与典型ABC 转运体NBD 大致保持一致,该螺旋上包含保守的Walker A基序,C端3个残基呈现310螺旋构象,导致Walker A与9号β 折叠的Walker B 基序发生相互作用。第2个结构域(图2b 蓝色)为信号域,主要由5 条α 螺旋组成,在底物识别及NBD与TMD的特异性和功能化连接中起到重要作用。此外,通过对比多个已知的NBD 结构域发现,NBD的第二个结构域中包含一段由约30个氨基酸残基组成的结构多样化区域(structurally diverse region,SDR),可与HlyB蛋白的TMD 特异地相互作用,因此该区域可能在不同NBD 对其同源TMD 的靶向性中发挥重要作用。2017年,Morgan等[12]采用X射线晶体学技术解析了超嗜热菌(Aquifex aeolicus) T1SS 内膜蛋白PrtD,该结构呈现为典型的同源二聚体,每个单体包含1个由6个N端跨膜螺旋(TM1~TM6)构成的TMD 和1个C 端NBD。其中6个TM 螺旋在NBD上方形成了大约长40 Å 的连续通道,提供底物进入窗口。PrtD 在TM3 和TM6 发生了高度扭曲,这些扭曲螺旋在T1SS ABC转运蛋白与底物的结合中起着关键作用。

1.2 膜融合蛋白(MFP)

在T1SS 中,MFP 参与底物识别,预先与ⅠMC结合形成稳定的ⅠM 复合物[44],通过与底物的结合,诱导ⅠMC 与OMP 接触,进一步通过改变3个组分的构象来实现底物的成功分泌。Kim 等[13]于2016年首次发表了大肠杆菌T1SS膜融合蛋白HlyD可溶性片段的晶体结构(图2c)。HlyD具有高度延长的α螺旋结构域,长度约为115 Å,由3个α螺旋(α1、α2、α3)和2个连接环(L1、L2)组成。其中,α3 比α1 和α2 长,导致了α3 能够与α1 和α2 发生相互作用:α3 的上半部分区域与α2 盘绕形成α螺旋发夹结构,其中L2 在α 螺旋结构域的顶端区域连接α2和α3。α3和α1的下半部分形成螺旋状结构。目前解析的HlyD结构尚缺少N端的95个氨基酸残基,以及C端的106个氨基酸残基,其完整的结构有待于进一步解析。

1.3 外膜孔蛋白(OMP)

1997年,Koronakis 等[45]解 析 了 大 肠 杆 菌T1SS外膜蛋白TolC的周质结构域,但是该结构的分辨率较低,仅为12 Å。2000年,该作者进一步提升了TolC 晶体结构的分辨率,达到2.1 Å[14],TolC 是由β 折叠、α 螺旋和混合α/β 结构域组成的桶装三聚体,蛋白质总长度为140 Å(图2d)。在三聚体中,12条β折叠链采用反平行的方式以右手螺旋形式形成β桶状结构,12条α螺旋链以左手螺旋形式形成α 桶状结构,2个桶状结构间通过含有脯氨酸的结构相连接。α螺旋形成的桶状结构内部通常保持部分或完全闭塞的状态,而β桶顶端的环状结构具有相对较高的原子位移参数,赋予其一定的构象迁移性,可作为该桶状结构的“盖子”以控制其开启或闭合。α桶的7、8号位螺旋组成外螺旋圈,能够与3、4 号位内螺旋圈进行相互作用并发生解旋行为,从而实现通道的打开和底物的转运。

Fig.2 Illustration of the structural model of the localization of T1SS图2 T1SS的结构示意图

2 Ⅱ型分泌系统(type Ⅱ secretion system,T2SS)

T2SS 广泛存在于革兰氏阴性细菌中,属于两步分泌,首先通过Sec/Tat 途径将未折叠的蛋白质以多肽形式转运至周质空间[46-47],并在此处实现蛋白质的折叠,进而将完全折叠的蛋白质通过T2SS分泌到细胞外环境,其底物包括各种水解酶,也可分泌许多细菌的重要毒素,如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的霍乱毒素、产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicE.coli,ETEC)和肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicE.coli,EHEC)[48-50]的不耐热肠毒素。以大肠杆菌为例,T2SS 主要由总分泌途 径 跨 膜 蛋 白 (general secretory pathway transmembrane protein,GSP)基因簇调控的12~15个蛋白质组成[51],按位置可分为3个部分,内膜部分主要由内膜蛋白GspC、GspL、GspM、多孔膜蛋白GspF以及1个六聚体ATP酶(ATPase)GspE组成,位于周质空间部分主要由GspG-K组成的假菌毛结构,外膜蛋白为GspD多聚体(图3a)。

Fig.3 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅱsecretion system图3 Ⅱ型分泌系统的结构示意图

2.1 内膜组分

在T2SS中,GspC、GspL和GspM是膜结合蛋白,均由跨膜片段和周质域组成,这些蛋白质与GspF 和GspE 结合,形成内膜组装平台(assembly platform,AP)。GspL 和GspM 可通过相互作用形成稳定的同源/异源二聚体[53],并与GspC 和GspE相互作用,在内膜平台的稳定性中发挥关键作用。GspE 是位于细胞质内的环状六聚体ATPase(图3b),能够与GspL和GspF相互作用。GspE的N端N1E结构域通过扩展接头连接到N2E结构域,N2E结构域又通过1个较短的柔性接头连接到C 端ATPase CTE 结构域。GspE 固有的灵活性会在与ATP/ADP结合后发生较大范围的构象变化,GspC、GspL、GspM和GspF 4种内膜蛋白的构象也会随之产生相应改变,从而保证整体结构的稳定性[24]。但目前这4种膜蛋白以及AP核心GspF结构尚未解析,对整个AP 机制的认识有待进一步的探索。

2.2 周质空间组分

T2SS包含一类假菌毛(pseudopilus) 蛋白GspG-K,与延伸到细胞膜外形成的菌毛不同,这种假菌毛结构往往局限于周质空间中(图3a)。最主要的假菌毛蛋白GspG 通过N 端螺旋锚定在内膜上,其他假菌毛蛋白GspH、GspⅠ、GspJ 和GspK聚集在GspG 的螺旋结构顶端(图3a),共同形成T2SS的周质结构。在底物插入GspD通道后,通过假菌毛结构的延伸,以活塞或螺旋推进的方式将底物推出通道,从而实现底物的转运[54]。

2.3 外膜

分泌蛋白GspD 是T2SS 最主要的外膜蛋白,由6个不同的结构域构成,包括N0、N1、N2、N3、分泌体(secretin)和S(图3c)[55],其中,N0、N1、N2 和N3 组成N 端结构域(N-terminal domain,NTD),与底物和T2SS的内膜组分相互作用;Secretin 和S 结构域构成C 端结构域(Cterminal domain,CTD),形成外膜孔状结构。2005年,Chami 等[56]运用冷冻电镜结合单颗粒分析(single particle analysis,SPA)技术首次解析了产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)GspD 结构,该结构呈现为十二聚体,基本特征是由2个环状结构在两侧形成腔室,中间存在1个具有堵塞通道的“塞子”结构,以防止细胞液外渗。2010年,Reichow等[55]运用冷冻电镜解析了霍乱弧菌GspD的结构,该结构也为十二倍对称的多聚体,但较克雷伯氏菌GspD 结构多出1个向外膜突出的结构,长约80Å(图3c)。因此,GspD外膜分泌蛋白被分为弧菌型和克雷伯氏菌型2个亚类(图3c)。

2017年,Yan 等[18]采用冷冻电镜单颗粒重构的方法解析了GspD 全长复合物的结构(图3c)。该研究首次揭示了GspD复合物为十五倍对称多聚体,不同于之前报道的十二倍对称多聚结构。该研究清晰展示了GspD 的N 端为环形通道结构,C 端为双层β 桶结构,由1个内β 桶(inner barrel)和1个外β 桶(outer barrel)组成,由外表面上的S 结构“手把手”围绕起来,从而维持双层β桶的稳定性。中间通道上保守的甘氨酸为其底物分泌的关键位点,能够使关闭的通道变成半开放状态,促进底物通过GspD通道向外分泌。

3 Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)

T3SS 是9 种分泌系统中组成最复杂的分泌系统,广泛存在于沙门氏菌(Salmonellaspp.)、弧菌(Vibriospp.)、志贺氏菌(Shigellaspp.)、假单胞菌(Pseudomonasspp.)等致病性革兰氏阴性菌中,可将效应物直接注射到宿主细胞的细胞质或质膜上,以实现细菌的定殖和入侵[57]。T3SS由20多种蛋白质组成,在物种间广泛保守,以一步机制分泌不同的底物(图4a),T3SS各亚基在不同物种中命名不同,因此本文采用标准化的“Sct”命名进行描述[58]。截至目前,人们已经对许多物种的T3SS进行了研究,并借助X射线晶体学技术及冷冻电镜技术确定了多数亚基的精确位置(图4)。该系统主要包括:基底(basal body)、底物输出装置(export apparatus)、 胞 质 环 与 分 选 平 台(cytoplasmic ring and sorting platform)、内杆及针状复合物(inner rod,needle and tip complex)、转运孔(translocation pore)。

Fig.4 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅲsecretion system图4 Ⅲ型分泌系统的结构示意图

3.1 基底

T3SS 基底是嵌入细菌内膜和外膜的一系列环状结构[59],主要由SctC、SctD 和SctJ 构成,其中SctC形成外膜环,SctJ和SctD在内膜形成同心环。SctC、SctD 和SctJ 都含有1个结构保守的楔形折叠,这是内膜环和外膜环共同的成环基序,有助于环的组装[60]。SctC 的N 端结构域深入周质,与SctD直接接触,实现内外膜的连接(图4a)。2016年,Worrall等[19]运用冷冻电镜解析了鼠伤寒沙门氏菌T3SS 基底的结构,呈现为典型的“螺母”与“螺栓”结构特征。其中,内膜环由PrgH(SctD)和PrgK(SctJ)组成,PrgH 包裹PrgK 形成2个呈二十四倍对称的嵌套同心环;外膜环为ⅠnvG(SctC) 蛋白(图4b),为十五倍对称多聚体,并在外膜中形成双层β 桶,其中外层桶状结构由β 三明治结构组成,内层β 桶形成“周质门”,确保底物选择性地通过β桶。

3.2 底物输出装置

底物输出装置位于基底下方,嵌入在内膜中,充当底物的入口,由5 种膜蛋白组装而成:SctR、SctS、SctT、SctU 和SctV(图4a)。据估计,共有104 种跨膜结构域参与了内膜输出装置的形成[61],呈现高度的结构复杂性。SctR、SctS和SctT构成1个以SctR 中心的五聚体,对底物输出装置的装配至关重要[62]。SctV 形成1个同源异构环,位于基底和ATPase 复合体之间,能够被整合到由SctR、SctS 和SctT 预组装形成的“注射器”基体中。SctU 是一种自体蛋白酶(autoprotease),其C 端结构域在切割前后呈现不同的构象,促使其与不同T3SS 元件发生相互作用,从而适应底物分泌过程中蛋白质结构转换[21]。目前仍缺乏SctR、SctS 和SctT 的结构信息以及SctU 和SctV 的跨膜结构域,有待进一步研究。

3.3 胞质环与分选平台

胞质环(SctQ)位于底物输出装置下方,与ATPase 复合体(SctN、SctL、SctO)一起组成底物的装载和分选平台(图4a)[63]。志贺氏菌、沙门氏菌等细菌的T3SS 分选平台都呈现为1个六倍旋转对称性结构,其具有中心枢纽和6个辐条(Spoke),每个辐条末端具有豆荚状结构。在分选平台中,ATPase 复合体中的SctN 由连接蛋白SctO锚定在SctV 的异构环上,从而连接ATPase 复合体与底物输出装置。而胞质环(SctQ)和SctK 位于SctL 的辐条末端,为SctN 提供对接位点,将SctN锚定在胞质环上,并调节其活性[64]。整体而言,胞质环负责底物的装载与卸载[65],ATPase 复合体为整个T3SS的运行提供能量[66]。

3.4 内杆及针状复合物

内杆(inner rod)由SctⅠ亚基螺旋组装而成,通过“插座(socket)”结构连接到内膜环,可将针状复合物(needle complex)锚定到基体[59]。针状复合物由数百个SctF 亚基螺旋组装而成(图4c)。每个单体的N 端结构域位于针管表面,C 端指向针腔,非保守的残基暴露在针状复合物表面,这可能反映了细菌逃避宿主细胞免疫反应的策略[26]。针状复合物在细胞外被尖端复合体(tip complex)SctA 覆盖,可以阻止针状复合物的伸长,也可防止效应物的过早分泌,帮助转运孔在宿主细胞膜的表面定位[67]。

3.5 转运孔

转运孔是由T3SS转运子SctB和SctE在宿主细胞膜脂质双分子层中形成的异源低聚复合体[68],也可自组装成异源十六聚体跨膜复合物[69]。最近的全基因组筛查显示,转运孔的组装和对接需借助宿主细胞的趋化因子受体[70]、表面硫酸化和岩藻糖化[71]、波形中间丝蛋白[72]等。但目前该结构缺乏高分辨率信息,其具体的机制和功能未知。

4 IV 型分泌系统(type IV secretion system,T4SS)

ⅠV 型 分 泌 系 统(Type ⅠV secretion system,T4SS)是一种广泛存在于细菌中多功能、多组分的跨膜转运系统。与已发现分泌系统不同,T4SS可对DNA 进行转运,因此该系统可实现细菌的接合转移、DNA释放和摄取、效应蛋白分泌等功能,以帮助细菌增强适应性和生存能力[73]。其中,T4SS 所介导的接合转移是基因水平转移的重要机制之一,多数接合型质粒和整合性接合元件都依靠自身编码的T4SS 实现耐药性和致病性等生物学性状 的 传 播[74]。植物病原菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) Ti 质粒、大肠杆菌R388、pKM101等接合质粒所编码的VirB/VirD4系统是T4SS的典型例子[75-76],该系统由12个亚基组成, VirB1、 VirB2、 VirB3、 VirB4、 VirB5、VirB6、VirB7、VirB8、VirB9、VirB10、VirB11 和VirD4 (图5a)。其 中,VirB6、VirB7、VirB8、VirB9 和VirB10 与VirB3 形成支架和转位装置,VirB2 和VirB5 形成延伸到细胞外空间的菌毛,VirB1 是一类周质溶菌糖基转移酶(lytic transglycosylase),可降解肽聚糖层,VirB4、VirB11 和VirD4 则是该系统3个重要的供能ATPase,按各亚基所处位置将该系统分为ATPase、内膜复合物、外膜复合物及菌毛4个部分。

Fig.5 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅳsecretion system图5 Ⅳ型分泌系统的结构示意图

4.1 ATPase

T4SS 的3个ATPase(VirD4、VirB4、VirB11)均为环状六聚体,位于易位通道的底部,构成细胞质能量中心并在底物转运过程中起到重要作用(图5b)。

VirB11 属于“Traffic ATPases”家族,该蛋白质的自磷酸化被认为在激活底物运输中起重要作用[77]。2000年,Yeo等[78]运用X射线晶体解析技术解析了幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)HP0525(VirB11)ADP 结合形式的结构,该结构由CTD组装成1个“六爪抓钩”,附着在由NTD组成的六聚环上,将结合的核苷酸夹在中间,通过调控ATP结合或释放实现该结构的开放与封闭[79]。

VirD4 是底物进入易位通道之前的结合受体,对接合过程至关重要[80-81]。R388质粒编码的TrwB是VirD4超家族的结构原型,2001年,Gomis-Ruth等[31]运用X 射线晶体解析技术解析了TrwB 可溶部分的结构,该结构具有1个保守α/β 核苷酸结合域(NBD)和1个与底物结合有关且序列可变的α结构域(AAD),通过N端的膜锚定序列拴在内膜上,为底物提供受体或识别模块,并参与单链DNA 转移[82-83]。此外,VirD4 还被证明存在1个N端跨膜结构域[80],但该结构目前尚未解析,因此底物在内膜的转运机制仍然未知。

VirB4 通常也由CTD 和NTD 2个结构域构成,其CTD是VirB4蛋白在进化上最保守的部分。2012年,Walldén等[29]运用冷冻电镜解析了乙醇栖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)VirB4 的CTD,该结构包含催化必需的Walker A和Walker B基序(图5b)。其保守程度较低的NTD被认为能够与细胞膜形成相互作用,根据物种的不同,预测有1~3个跨膜区,其酶活性对底物从VirB11到内膜通道VirB6/VirB8的移交至关重要[84]。此外,该蛋白质对菌毛的产生[85]和毒力[86]至关重要。

VirD4、VirB4 和VirB11 被证明可能存在一定地相互作用[87],2018年,Chetrit等[88]运用冷冻电镜断层扫描技术解析了嗜肺军团菌Dot 系统结构,其中DotO(VirB4)与DotB(VirB11)组装产生了1个细胞质通道,DotL(VirD4)则临时地与效应物或细胞信号组装,引导底物的转运。因此,这3个ATPase 很可能形成1个大的ATPase 复合体,为底物的转位提供通道及能量,但仍需要进一步验证。

4.2 内膜复合物

内膜复合物主要由VirB3、VirB6、VirB8 组成,以不同方式促进转运通道的形成。VirB8 是一种双功能内膜蛋白,由NTD 和1个较大的周质CTD 组成,2006年,Bailey 等[32]运用X 射线晶体解析技术解析了根癌农杆菌VirB8的周质CTD,呈现为同源二聚体,在二聚体接触界面存在2个高度保守域,对二聚体的相互作用及稳定性起到重要作用,并为其他VirB蛋白和DNA底物提供潜在结合位点,但目前该蛋白质的NTD 尚未解析。现有数据表明,VirB3 与VirB2 和VirB4 在内膜上相互作用,但其结构尚未解析,对T4SS 的确切作用也尚不清楚[89]。VirB6是一种多位点内膜蛋白,由1个周 质NTD、5个TM 和1个 细 胞 质 内 的CTD 构成[90],对底物跨内膜的分泌具有重要作用[91],但目前该蛋白质的结构尚未解析,仍有待进一步解析。

4.3 外膜复合物

2018年,Sgro等[33]运用冷冻电镜解析了柑桔黄单胞菌(Xanthomonas citri)T4SS 外膜复合物,该结构由VirB7、VirB9 和VirB10 组成,呈十四倍对称,由插入外膜的外层(O 层)和内层(Ⅰ层)组成,构成1个中空腔室。其中,Ⅰ层由VirB9 和VirB10 的N 端结构域组成,通过VirB10NTD锚定在内膜上,在底部形成1个直径为80Å的孔。O层由VirB7 以及VirB9 和VirB10 的CTD 构成(图5c),VirB10CTD在顶部形成“盖子”,并存在1个直径为45Å 的孔,允许O 层的腔室和细胞外环境相联系,该结构还存在1个脯氨酸富集域,负责核心复合体组装和底物分泌[92]。VirB7是一种插入外膜的小分子脂蛋白,主要由1个α/β 构成的球状CTD、1个与VirB9CTD相互作用的N 端序列以及1个可与其他VirB7 亚基相互作用的α 螺旋组成,在外膜复合物的形成中起到重要作用。VirB9由2个结构域组成,其NTD 由1个β 三明治结 构及1个α 螺旋组成,CTD 则为1个由β 折叠组成的结构域,这2个结构域由1个柔性α 螺旋连接子连接[93]。VirB10NTD与VirB9NTD具有一定的柔性,可在底物转运过程中产生相应的构象变化,以适应底物的加载及转运。

4.4 菌毛

T4SS 菌毛由主要蛋白VirB2 和次要蛋白VirB5构成[94]。目前,VirB2 蛋白的结构解析主要围绕F菌毛的研究展开。F菌毛是延伸到细菌细胞外空间的细丝,介导细菌对靶细胞的附着,通过收缩将2个细胞拉在一起,从而建立直接的细胞-细胞接触,并最终形成耐SDS 和抗剪切的“交配连接”[95]。2016年,Costa等[34]运用冷冻电镜解析了分别由F质粒和pED208质粒编码T4SS的F型菌毛结构,二者均由VirB2 五聚体堆积而成(图5d)。在该结构中,磷脂酰甘油(PG)与VirB2 以1∶1 的比例存在于菌毛中,以促进菌毛与宿主细胞膜融合、重新插入供体细胞、最终菌毛解聚等动态过程。VirB5位于菌毛的顶端,在菌毛组装、DNA 转移及特异性识别等方面发挥重要作用[94]。2003年,Yeo等[35]运用X 射线晶体解析技术解析了pKM101 质粒编码的VirB5同源物TraC,该蛋白质由三螺旋束和松散的球状附属物组成,位点突变结果表明VirB5在菌毛组装中发挥重要作用。

5 Ⅴ型分泌系统(type Ⅴ secretion system,T5SS)

T5SS 也被称自主转运蛋白系统(autotransporters),其特点在于该系统的分泌蛋白C 端β 结构域一旦插入OM,就形成了允许分泌转运的β 桶状结构,从而驱动蛋白胞外分泌[96]。与T2SS 相似,T5SS 也为两步分泌系统(图6a),主要参与细胞间的黏附和生物被膜的形成[97]。

自主转运系统主要由信号肽(signal peptide)、乘客结构域(“Passenger”domain)及易位单元(translocation domains)[4]3个结构域构成。信号肽存在于自主转运蛋白的N 端,可将其定位到内膜Sec 转运蛋白;乘客结构域,又被称为α 结构域或N结构域,它可赋予自主转运蛋白不同的功能;易位单元也被称为β结构域或C结构域,便于乘客结构域的转运[104]。目前,根据T5SS 不同的结构及跨膜特性将其分为5类,即Va~Ve(图6b)。

Fig.6 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅴsecretion system图6 Ⅴ型分泌系统的结构示意图

5.1 Va

Va 为经典的自主转运系统(autotransport systems,ATS),2010年,van den Berg[36]运用X射线晶体学技术解析了第一个全长自主转运蛋白EstA,该蛋白质存在1个相对狭窄的12股β桶状结构,该结构通过β桶管腔内的α螺旋连接到乘客结构域。该蛋白质乘客结构域呈现为1个以α螺旋和环状结构为主的球形折叠,为底物换乘提供动力。不过,大多数Va 的乘客结构域呈现为螺旋状β 折叠结构,如百日咳杆菌黏附素(pertactin)(PDB:1DAB)(图6b)。对Va 而言,自体转运蛋白通过Sec转运体穿过内膜,其所含的延伸信号肽仍附着在Sec上。在周质中,伴侣蛋白与自主转运蛋白结合并打开,随后信号肽被信号肽酶切割,释放自体转运蛋白。自主转运蛋白C 端被BamA 的POTRA结构域识别,连接域在β桶内形成1个发夹,并将乘客结构域拉至分泌孔,进而在蛋白酶的作用下将其转运至胞外[104]。

5.2 Vb

Vb 又称为双伴侣转运系统(two-partner secretion systems,TPSS),与经典的自主转运蛋白不同,TPSS 中乘客结构域和易位单元位于不同的多肽链中,乘客结构域被称为TpsA,易位单元被称为TpsB[102]。与众多自主转运蛋白一样,TpsA蛋白含有1个延伸的信号肽[105],其N 端含有1个高度保守的结构域,约300个残基构成,被称为双伴侣分泌(TPS)结构域[106]。百日咳博代式杆菌(Bordetella pertussis)丝状血凝素黏附素(FHA)/FhaC 是典型的双伴侣分泌系统[107]。2004年,Clantin 等[108]利用X 射线晶体学技术解析了FHA的TPS 结构域,呈现为一个β 螺旋,同时携带3个螺旋外基序,其中β 螺旋为FHA 整体结构的构建提供支架,螺旋外基序则起到识别易位单元等作用。2007年,该作者解析了FhaC 的结构,该结构呈现为一个16股β桶,与EstA同源。β桶内存在一个N 端α 螺旋,周质部分由2个POTRA(P)结构域构成,该结构域提供了TpsA 的结合位点[109]。TpsA 的TPS 结构域能够与其同源TpsB 的POTRA结构域相互作用[110],进而通过自主转运蛋白水解机制将TpsA蛋白转移到细胞外空间[111]。

5.3 Vc

Vc 为三聚体自主转运蛋白的转运系统,该类蛋白通常为黏附素(trimeric autotransporter adhesins,TAAs),能够不依赖自主转运蛋白的水解机制进行释放。TAAs具有模块化和重复的结构,常以三聚体的形式存在。2006年,Meng 等[104]解析了流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)黏附素Hia 易位单元的结构,为三聚体组成的β 桶状结构,每个亚基由4条β链和1条α螺旋构成,桶内由3 条α 螺旋贯穿。2012年,Shahid 等[112]利用固态核磁共振技术解析了小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)黏附素YadA 易位单元的结构,也呈现为三聚体组成的β桶状结构。

5.4 Vd及Ve自主转运系统

Vd 自主转运系统最早被发现于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Patatin样酯酶PlpD的分泌过程,其乘客结构域是一种解脂酶,在自身转运完成后被自动催化水解。但与Va 系统不同,其乘客结构域通过POTRA 结构域连接到易位单元β 桶结构域[113],但其具体结构仍未解析。Ve自主转运系统是T5SS 的新成员,2012年,Leo 等[111]根据结构特征首次将紧密黏附素/侵袭素家族蛋白称为Ve 转运系统,其乘客结构域与易位单元的位置与Va 系统相反,并且在细菌表面形成寡聚复合物,该复合物C 端的易位单元能够相互作用形成1个β桶状结构,起到膜锚定作用。但目前仍缺乏Ve 的整体结构,有待进一步解析。

6 VI 型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)

T6SS 是一种类似“弩”的跨越细胞膜的大分子机器,首次发现于非O1/O139 的霍乱弧菌中[114],它可将底物注入靶细胞或环境中,从而实现致病性、细菌间交流、生物被膜形成、环境应激等细菌生理反应[115-116]。与其他分泌系统不同,该系统可同时将多个效应物输送到靶细胞。T6SS 主要由13个保守的、必不可少的核心部件和几个附属部件组成(图7a)[117-118],依据其所处位置大致可分为膜复合体和尾部复合物。其中,尾部复合体与噬菌体的可收缩尾部具有一定相似性[119],通过膜复合体锚定在细胞膜上。

Fig.7 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅵsecretion system图7 Ⅵ型分泌系统的结构示意图

6.1 膜复合物

T6SS 膜 复 合 物 由TssJ、TssL 和TssM 组 成,TssM 将外膜脂蛋白TssJ 与内膜蛋白TssL 连接[118],组成从细胞质延伸到周质空间的蛋白质复合物。2015年,Durand等[37]利用负染电子显微镜确定了完全组装的复合物结构,该复合物呈现五倍对称构象,其中,TssM 由2个结构域组成,其NTD 是由4个α 螺旋组成的1个螺旋束,一侧被β 发夹覆盖,另一侧被C端伸展部分覆盖。CTD则是由9条β链组成的β三明治结构,该结构与TssJ相连(图7b)。TssJ结构与TssM的CTD类似,由2个4条β链组成的1个β片层和1个α螺旋组成。

6.2 尾部复合物

研究表明,T6SS 尾部复合体由类似于噬菌体可收缩尾巴的结构元件组成, 包括基板TssK-TssF-TssG、刺突蛋白VgrG、尾鞘TssB-TssC和内管Hcp 管(Hcp tube)。其中,尾鞘为垂直于内膜的长管状结构并深入细胞质[121],刺突蛋白、内管和尾鞘在基板平台组装而成,TssK 将膜复合物与尾部复合物连接在一起。

6.2.1 基板复合物TssK-TssF-TssG

在T6SS 组装过程中,基板对接膜复合物,可引发尾部管/鞘聚合,还可作为效应物分拣平台[121-122],通过VgrG绑定效应因子[123],因此基板是T6SS 的核心部件。2018年,Cherrak 等[38]运用冷冻电镜解析了大肠杆菌的基板复合物,该结构呈现为由楔形复合物亚基组成的六聚体,在楔形复合物中,TssG 和2个TssF(TssFa 和TssFb)组装成T6SS 楔形复合物的金字塔帽,2个TssK 三聚体与TssG 相互作用实现楔形复合物的组装,在每个分泌周期中,楔形复合物的延迟聚合和快速循环组装有助于VgrG及效应物的释放。

TssK 三聚体亚基从N 端到C 端依次可分为N端α 螺旋、β 夹心结构域(也称为Shoulder 域)、4条α螺旋组成的螺旋束(也称为Neck区)和C端α/β 结构域(也称为Head 域)(图7c)4个部分,TssK 是介导基板对接膜复合物的主要因素。最近发现[124],TssK结构域与长尾噬菌体(Siphophage)受体结合蛋白具有同源性,但它已经进化出一个特定的C 端Head 结构域,以膜复合物为受体,实现连接。

TssG由2个球形区域组成,TssG-D1由Head域组成,TssG-D2 则由Body 域和Foot 域组成,Neck域将其分开(图7d)。TssG是楔形复合体的中心骨架,将TssFa与TssFb相连(图7d)。

TssF 是一种球状蛋白,其N 端延伸部分称为Antenna结构域,由2条α螺旋组成,而C端球形结构域可分为5个亚域。结构域1(TssF-D1)呈现β三明治结构,两侧是含有短α 螺旋的环;结构域2(TssF-D2)也是β 三明治结构;结构域3(TssFD3)是α螺旋结构域,由3个短螺旋组成;结构域4(TssF-D4)是由1个螺旋和4 条β 折叠链组成的α/β 片层;结构域5(TssF-BD)称为分支域,将Antenna 与TssF-D1、TssF-D2 以及TssF-D3 连接组成β-三明治结构。

6.2.2 VgrG刺突蛋白

VgrG 刺突蛋白位于内管前端,其C 端针状β螺旋能够穿透宿主细胞膜,并可连接其他效应物的结构域[121]。PAAR蛋白可在VgrG三聚体顶端形成圆锥形结构,使尖端变尖(图7d),帮助VgrG 对宿主细胞的插入。2013年,Shneider 等[120]运用X射线晶体学技术解析了PAAR-VgrG复合物的结构,其中,仅解析了VgrG 的可溶性部分,为3个β 片层组成的针状β螺旋,PAAR呈现为9条β折叠链构成的锥形结构,其中3条β折叠链形成锥形结构底座与VgrG结合,另外6个β折叠链形成3个指向锥体顶点的β 发夹结构,该结构完全占据β 螺旋的C端结构域,负责在靶细胞细胞膜上产生开口,并且作者预测PAAR 蛋白可携带效应结构域与VgrG 结合,通过T6SS 转移到靶细胞[125]。因此,T6SS 可在鞘收缩驱动的易位中向宿主细胞运送多个效应因子。

6.2.3 尾鞘TssB-TssC

2014年,Kube 等[126]运用冷冻电镜解析了霍乱弧菌尾鞘的结构,由6个TssB-TssC 丝状复合物构建,以30°旋转角度堆叠在一起,形成六倍对称的齿轮状结构(图7e),并且该结构存在1个由4条β 链组成的核心区,用于稳定尾鞘结构。2017年,Wang等[39]通过在VipA(TssB)N端插入3个氨基酸残基,获得了延伸状态的霍乱弧菌T6SS 尾鞘-内管复合物,作者进一步揭示了T6SS通过推动和旋转内管来进行尾鞘收缩,以穿透靶细胞膜。此外,ATPase ClpV可实现对尾鞘的分解,以确保尾鞘亚基的循环组装[121]。

6.2.4 内管Hcp管

内管由溶血素共调解蛋白(hemolysincoregulated protein,Hcp)构成,Hcp 既可介导细菌的宿主体内定殖,还可实现对宿主的接触性溶血[127],具有结构蛋白和效应蛋白的双重作用[128]。到目前为止,已经确定了6个Hcp的晶体结构,均具有相似的六面体环状结构,其亚基通常由2个β片层和1个α螺旋组成[129-132],但其功能差异较大。Suarez等[133]研究表明,铜绿假单胞菌的Hcp降低了巨噬细胞对细菌的摄取,抑制宿主免疫反应,促进细菌复制和传播,但Lim等[134]对类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)Hcp 的研究中,并没有发现Hcp对细胞信号或细菌致病性存在任何影响。因此,Hcp 在不同细菌中可能存在一定差异,需要得到进一步的探究。

7 VII 型分泌系统(Type VII secretion system,T7SS)

T7SS是革兰氏阳性菌所特有的蛋白分泌系统,用于代替Sec 或Tat 途径,最早在疫苗株牛结核分枝 杆 菌(Mycobacterium tuberculosis) 中 被 发现[135]。研究表明,该菌携带5个相邻的T7SS(Esx-1至Esx-5),且具有不同的生理功能,其中研究较多的是Esx-1 和Esx-5[136-137]。Esx-1 参与细菌对吞噬小体的逃逸,对细菌的毒力至关重要。Esx-5 只存在于生长缓慢的分枝杆菌中,参与宿主的免疫反应调节和细菌生物被膜完整性的调控[136]。目前,T7SS的结构尚未得到完整解析,且由于该系统外膜蛋白尚未明确,因此本文仅对该系统的组成进行介绍。

目前,预测形成T7SS 的蛋白质有EccA、EccB、EccC、EccD、EccE 和MycP 6 种(图1)。除可溶性ATPase EccA外,其余均为膜蛋白。EccC是属于FtsK/SpoⅠⅠⅠE 家族的ATPase,其远端NBD与底物EsxB 结合,激活ATPase 的寡聚及酶活性。EccD亚基预测有11个的跨膜螺旋,因此推测它可能参与了转位通道的形成[138]。然而,关于它的确切作用或其他T7SS 亚单位EccB 和EccE 的功能尚不清楚。2017年,Beckham等[139]运用负染电镜解析了蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)ESX-5亚复合体的三维结构,EccB5、EccC5、EccD5和EccE5呈现为1个5 nm 孔洞的六倍对称复合物,约1.5 Mu,足以允许折叠的EsxA/EsxB底物转运。但目前T7SS 外膜蛋白的具体结构和底物的分泌机制未知,有待进一步探索。

8 VIII 型分泌系统(type VIII secretion system,T8SS)

T8SS 被称为淀粉样卷曲纤维(Curli)生物合成途径,多存在于肠杆菌科中,用来分泌Curli,该纤维蛋白由CsgA 和CsgB 两种亚基组成,能够促进生物被膜的形成,并与宿主免疫系统相互作用,以保护细菌抵御恶劣环境[140]。作为两步分泌系统,T8SS需要依赖Sec将底物转运至周质空间,再由外膜蛋白运输到膜外(图8a)。

T8SS 的外膜复合物主要由可溶性辅助因子CsgE、CsgF 以及外膜脂蛋白CsgG 组成。CsgE 和CsgF 介导Curli 蛋白的分泌和定位[141]。这些蛋白质发挥不同作用,其中CsgE被认为是CsgA的特异性伴侣,既帮助CsgA 分泌,还会抑制体外CsgA聚合。CsgF 则为CsgB 的伴侣蛋白,确保CsgB 表面 暴 露,从 而 与CsgA 发 生 聚 合[142]。2014年,Goyal 等[143]运用X 射线晶体学技术解析了大肠杆菌CsgG 的结构,由9个亚基组成寡聚体,每个亚基提供4条β链,组成36链β桶状结构。整个复合物在周质侧形成1个内径为35 Å、高度为40 Å 的空腔,由2号位α螺旋形成周质开口,约50 Å。空腔内衬为氨基酸残基Tyr、Asn和Phe形成的3个同心环堆叠构成。通过CsgG 及其同源物的多序列比对表明,Phe 或Asn 的改变可能会终止Curli 的合成。

2020年,Yan 等[40]运用冷冻电镜解析了大肠杆菌CsgG-CsgF复合物结构(图8b),CsgF的N端结构域与CsgG连接,C端结构域通过与CsgB的特异性结合与Curli 相连接。在CsgF-CsgG 通道的周质侧,存在9个裂隙能够捕获CsgA的N端结构域,从而为CsgA 提供特异性和高度保守的识别位点。该研究还证明,CagA可通过其C端残基与CsgE相互作用,显著增强转运效率。同年,Zhang 等[144]也运用冷冻电镜解析了大肠杆菌CsgG-CsgF复合物的结构,如前所述,在管腔内部也存在由Tyr、Asn 和Phe 的侧链形成的同心环(图8c)。综上研究表明,CsgG-CsgF 相互作用具备2个主要特征。首先,CsgF 的N 端结构域与CsgG 结合,1个连接环延伸到CsgG 通道中心,形成插入CsgG 通道的漏斗状结构,从而与CsgG 形成稳定复合物。其次,CsgF 可同时结合2个相邻的CsgG,增强CsgG-CsgF 复合体通道的稳定性,以完成Curli 亚基的分泌和聚合。

此外,Curli 主要亚基CsgA 和次要亚基CsgB位于细胞表面,均为β 片层结构,CsgA 通过与细胞表面CsgB 相连核化成淀粉样纤维[145]。CsgC 是一种天然的细菌淀粉样蛋白抑制剂,被证明可通过静电相互作用来抑制CsgA初级成核和/或延伸,保持其无定形、无链状态,以防止其对宿主细胞的毒性[146-147]。然而,在Curli 生物合成过程中,CsgC、CsgE 的细节结构及其机制目前尚不清楚,有待进一步研究。

Fig.8 Illustration of the structural model of the localization of type VIII secretion system图8 VIII型分泌系统的结构示意图

9 IX 型分泌系统(type IX secretion system,T9SS)

T9SS目前仅在拟杆菌门(Bacteroidetes)中被发现,用于分泌蛋白质或实现滑行运动。该系统根据细菌不同的生活方式发挥不同作用,可为环境细菌提供滑行运动,如经常在水和土壤中发现的共生微生物—— 约式黄杆菌 (Flavobacterium johnsoniae)[148];也可分泌细菌的黏附素和毒力因子等[149],如人类牙周炎主要病原体——牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)[150]。T9SS 由1个双组分系统调节,确切的触发信号还未明确。T9SS 分泌蛋白通常具有保守的CTD,将其靶向到T9SS,滑行运动则是依赖运动性黏附素实现[149]。由于不同细菌T9SS 的结构有所区别,因此,本文仅基于已获取的三维结构信息(图9a),对部分T9SS结构蛋白进行综述。

2018年,Lauber等[41]运用冷冻电镜对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)T9SS外膜蛋白Sov(SprA)的结构进行了解析,为36 条链组成的β桶状结构,其内部孔直径约为70Å,允许折叠后的蛋白质通过。SprA 孔的周质侧被Plug 蛋白堵塞,外膜侧被PorV 交替堵塞,这可防止非特异性物质的渗漏。在SprA-PorV复合体中,侧壁开口完全被PorV 阻塞,并通过其外表面结合(图9b左),允许从周质接收底物进入SprA通道,底物释放后,Plug 再将SprA 通道的周质口封闭(图9b右)。

PorV、PorU、PorZ 和PorQ 能够形成复合物,修饰分泌物并将其黏附到细胞表面[151]。除PorQ、PorU 外,其他蛋白质均得到了一定程度的解析。PorV属于FadL家族,为14条β折叠链组成的外膜孔蛋白,孔被N 端结构域堵塞,在该系统中PorV可护送分泌蛋白通过SprA 通道运输到胞外[151]。PorU 是一种肽酶,负责在底物分泌后,清除分泌蛋白的C 端信号域[152],也可通过“sortaslike”机制将新暴露的分泌蛋白C 端共价连接到脂多糖A-LPS 上[153],PorU 的精确定位和稳定性依靠PorZ。PorZ 是T9SS 在膜表面的必要组成部分,2016年,Lasica 等[42]运用X 射线晶体学技术对牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)PorZ 进行了解析,该结构由3个亚基组成,前2个为N 端7股β螺旋桨βD1和βD2,每个β螺旋桨具有“入口侧”和“出口侧”。CTD 为七股反平行的β 折叠构成的类免疫球蛋白状结构(图9c),但该蛋白质与分泌蛋白的结合方式尚未确定,有待进一步探索。

Fig.9 Illustration of the structural model of the localization of type IX secretion system图9 IX型分泌系统的结构示意图

10 靶向细菌分泌系统的抗菌剂研发

全球范围的抗生素滥用加剧了细菌耐药性的发展,对公众健康构成巨大威胁,因此开发可替代抗生素的新型抗菌剂极为迫切[154]。与抗生素相比,以细菌分泌系统重要毒力蛋白为靶点,筛选和设计的靶向小分子药物,可有效抑制细菌基础生命活动,降低细菌的毒力,且不易产生耐药性。本章将讨论以细菌分泌系统为靶标开发新型抗菌药物的最新进展。

T3SS 可作为开发抗菌治疗药物重要靶点[155],目前已经展开广泛研究。在T3SS表达及转录层面,发现了一系列靶向抗菌剂,如水杨醛酰酰肼、N-羟基苯并咪唑、苯氧基乙酰亚胺、2-亚氨基-5-芳基乙基唑烷酮等,可有效防止细菌注射效应蛋白而引起宿主感染[156]。近年来,随着T3SS 复合物结构的逐步解析,许多靶向T3SS 蛋白结构的抗菌剂也得到进一步开发。2011年,Swietnicki 等[157]以鼠疫杆菌(Yersinia pestis)T3SS SctN(YscN)为靶标,筛选出6个可有效抑制该蛋白质的化合物,显著降低了鼠疫杆菌的毒力。2014年,美国制药公司Kalobios 首次报道以铜绿假单胞菌T3SS尖端蛋白PcrV 为靶点,开发了抗体KB001-A 作为铜绿假单胞菌T3SS 抑制剂,用于治疗由慢性铜绿假单胞菌感染引起的呼吸道炎症和囊性纤维化(CF)的患者,这也是已知的第一种用于临床治疗的T3SS 抑制剂药物[158]。2019年,Feng 等[159]基于荧光偏振的高通量筛选方法,发现了可有效抑制T3SS针复合物组装的天然草药化合物-丹参酮,并通过体内外实验验证了该化合物可有效缓解铜绿假单胞菌引起的肺部感染。2020年,Case 等[160]利用志贺氏菌T3SS 的ATP 酶Spa47 晶体结构,计算筛选760万种药物化合物,表征并鉴定了多种新型Spa47抑制剂,并且该研究表明,这种新型抑制剂可靶向大肠杆菌、沙门氏菌等细菌T3SS的ATP酶,显著降低这些致病菌的毒性。

此外,研究人员针对其他分泌系统也展开了新型抗菌剂的研究。2019年,Massal等[161]以铜绿假单胞菌双精氨酸易位(Tat)系统和T2SS 为靶点,通过高通量筛选确定出3 种Tat 抑制剂和1 种T2SS抑制剂,为开发抗铜绿假单胞菌的新型抗菌剂奠定基 础。2011年,Paschos 等[162]针 对 布 鲁 氏 菌(Brucella abortis)T4SS VirB8 筛选出48 种特异性的小分子物质,其中化合物B81-2 可有效影响VirB8 的二聚化,从而抑制布鲁氏菌在巨噬细胞中的生长,并降低其对宿主细胞的毒性。2019年,Arya 等[163]以幽门螺旋杆菌T4SS CagA(VirB11)为靶点,筛选出可抑制该ATP 酶六聚化的抑制剂,可有效降低其酶活性,进而降低该菌毒力。2021年,Cherrak[164]等靶向大肠杆菌T6SS 基板复合物TssK-TssF-TssG,设计了一种可阻断基板复合物组装的仿生环肽(BCP),该肽是第一个完全根据先前的结构信息设计的具有抗T6SS 活性的化合物,为抗T6SS 抑制剂的开发提供思路。综上,针对细菌分泌系统重要毒力蛋白,已开发的新型抗菌剂验证了该思路的有效性及可靠性,为后续靶向抗菌剂的开发奠定良好基础。

11 展 望

近年来,作为一大类与致病力、生存力等密切相关的大分子复合物,细菌分泌系统得到了广泛研究,明晰了大部分细菌分泌系统的主要组成,结构生物学的发展也为揭示各种分泌系统的结构及其部分亚基结构的解析提供了良好基础。细菌分泌系统最少的由3个亚基单位构成,复杂的T3SS 及T9SS则多达20~30个亚基单位,这些复杂的大分子复合物为细菌的分泌蛋白、DNA 及小分子物质等提供了通道。因此,对细菌分泌系统的深入探究,有助于进一步理解细菌的致病、耐药、环境适应等机制。但由于细菌分泌系统结构的复杂性,对其结构的解析还较为局限,例如T7SS、T9SS这些分泌系统的具体结构仍处于未知,此外对于一些已经得到解析的分泌系统,其底物的具体转运过程也属于研究空白,限制了人类对这些系统转运机制的深入了解。因此,本文针对细菌分泌系统的未来研究提出以下3点展望。

11.1 进一步探索细菌分泌系统结构及转运机制

电镜技术的发展及蛋白质相关生化数据的积累,推动了细菌分泌系统具体结构的阐明,使多种细菌分泌系统的结构及组成得到了较好的解析。但目前,由于蛋白质复合物难以表达、不够稳定、产量较低等一系列问题,导致一些分泌系统结构的解析十分困难。此外,传统X射线晶体学技术虽被视为结构解析的“金标准”,但具有结晶困难、周期较长、晶体不稳定等缺陷。随着单颗粒冷冻电镜(single particle cryo-EM) 和冷冻电镜断层成像(cryo-electron tomography,cryo-ET)等技术的迅猛发展,可为分泌系统结构及转运机制研究提供绝佳的科研手段。此外,目前主要解析了革兰氏阴性细菌的众多细菌分泌系统,VⅠⅠ型分泌系统等革兰氏阳性细菌的分泌系统尚未得到彻底研究,限制了针对革兰氏阳性细菌分泌系统的新型抑菌剂开发。因此,明晰这些未知结构的组成及功能,以及这些结构在效应物转运过程中的变化及互作位点,以期全面认识细菌分泌系统。

11.2 不同细菌分泌系统相互作用机制的进一步探索

分泌系统在细菌发挥致病性过程中起到重要作用,同一细菌细胞内可能存在多种不同类型的分泌系统,例如,本课题组前期研究表明,副溶血性弧菌同时存在T3SS和T6SS,并在该菌致病过程中发挥中重要作用,且二者均受到AphA、ToxR、OpaR 的调控[11]。铜绿假单胞菌也存在T3SS 和T6SS,二者分别通过c-di-GMP 和RetS/GacS 途径来协同调控病原菌的生存方式及其感染策略[165]。因此,应充分探索不同细菌分泌系统间的相互作用,以明晰其在发挥致病过程中潜在的协同互作机制。

11.3 靶向细菌分泌系统的抗菌剂研发

基于细菌分泌系统进行新型抗菌剂的研发,为取代或帮助传统抗生素疗法开辟了新的治疗途径。近年来,细菌分泌系统高分辨率结构的解析,为靶向抑菌小分子的高通量筛选及抗菌肽设计提供了重要基础。但目前针对细菌分泌系统的新型抗菌剂研发尚未得到全面探究,仅局限于一些细菌分泌系统的部分毒力蛋白,并且这些新型抑菌剂从实验室开发到临床应用还存在一定距离。因此,未来研究可进一步开拓细菌分泌系统的毒力蛋白相关结构,并将其作为潜在的药物靶点,进行靶向抑菌剂的筛选和研发,为有效解决抗生素耐药性问题提供新的策略。

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