一种负载石榴皮提取物静电纺纳米纤维膜的制备与表征*

王先柱 李长恩 张现歌 翟志毫 王译泽 王 颖

新疆大学 纺织与服装学院，新疆 乌鲁木齐 830017

医用敷料是一种用于处理皮肤伤口的医疗用品。理想的医用敷料应具备保护伤口不受病原体侵袭，能吸收和控制渗出物的功能，并可通过保持伤口处的湿润微环境，促进伤口愈合[1]。纳米纤维材料具有直径小、比表面积大、孔隙率高以及力学性能良好等优点[2]。此外，纳米纤维的三维结构与人体的细胞外基质结构相似，用纳米纤维制备的伤口敷料具有止血、预防病原体入侵、促进细胞增殖和迁移等功能[3]。基于此，纳米纤维已成为伤口敷料制备领域的研究热点。静电纺丝技术因易操作、成本低等优势，成为制备纳米纤维的主要方式之一。通过向静电纺纳米纤维中添加化学药物或活性物质，还可增加纳米纤维敷料的功能[4]。

微生物感染是造成伤口延迟愈合的主要原因。目前利用静电纺丝技术制备纳米纤维敷料时，添加的物质多为抗生素类药物[5]。这些化学药物虽能够有效抑制有害微生物的生长，加速伤口愈合，但长期使用抗生素类药物不仅会导致有害微生物产生耐药性，而且制备的静电纺纳米纤维敷料也功能单一。基于此，纯天然、多功能的植物提取物成为制备静电纺丝纳米纤维敷料的研究热点。

石榴树是一种石榴科石榴属的落叶型乔木，其果实具有食用与药用价值。新疆作为我国石榴的主要产区之一，年产石榴高达5万～6万t。石榴皮作为石榴果实中不能食用的一部分而被废弃，造成了大量的资源浪费[6]。研究表明，石榴皮提取物(pomegranate peel extract，PPE)中富含安石榴苷、鞣花酸等多种活性成分，具有抗菌、抗氧化、驱虫、止血和涩肠等作用，是临床上常用的中药之一[7-8]。Aslam等[9]研究发现，石榴皮中的脂溶性成分对人体皮肤中成纤维细胞的生长有促进作用。谢贞建等[10]研究发现，PPE可增强大豆油的抗氧化效果。Murthy等[11]研究发现，PPE对大鼠切除性伤口的愈合有促进作用。现代药理学研究表明，石榴皮的主要活性成分是多酚类化合物，该类化合物具有明显的抗氧化、抗菌、抗癌和促进伤口愈合等作用[12]。然而，目前还未有利用PPE制备静电纺纳米纤维敷料的报道。

本文利用静电纺丝技术，制备含不同质量分数PPE的聚己内酯(PCL)/PPE复合纳米纤维膜，并对纳米纤维膜的微观形貌、抗菌性和抗氧化性等性能进行测试与表征，探讨PCL/PPE复合纳米纤维膜在伤口敷料领域的潜在应用。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

石榴皮，收集于新疆乌鲁木齐地区；PCL、N-N-二甲基甲酰胺(N-N-Dimethylformamide，DMF)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和无水乙醇，购自乌鲁木齐科华伟业生物科技有限公司；氢氧化钠、氯化钠、牛肉膏、蛋白胨和琼脂，购自上海阿拉丁试剂有限公司；大肠埃希菌(E.coli，ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 25923)，购自中国南通凯恒生物技术有限公司；白色念珠菌(C.albicans，BNCC 186382)，购自北纳生物科技有限公司。

1.2 PPE的制备

将收集到的石榴皮用去离子水洗涤2次，去除杂质，置于阴凉处晾干后粉碎，其粉末过粒径为425 μm(40目)筛网。称取过筛后的石榴皮粉100 g，加入600 mL体积分数为80%的甲醇，在60 ℃恒温水浴中加热回流提取4 h，共提取3次。过滤提取液后，利用旋转蒸发仪(RE-5205A型，上海亚荣生化仪器厂)将提取液浓缩至浸膏状，收集PPE浸膏并储存于4 ℃环境下备用。

1.3 纳米纤维膜的制备

以DMF为溶剂，制备质量分数为20%的PCL溶液。向PCL溶液中分别加入质量分数为3%、6%和9%的PPE，得到不同PPE质量浓度(分别为30、60和90 mg/mL)的纺丝液，搅拌14 h，通过静电纺丝技术制备纳米纤维膜，分别命名为PCL/3PPE、PCL/6PPE和PCL/9PPE，并以PCL纳米纤维膜作为空白对照。静电纺丝工艺参数如下：针头与收集器之间的电压为21 kV，接收距离为18 cm，纺丝液流速为0.5 mL/h，针头规格为23 G。

1.4 场发射扫描电子显微镜测试

将纳米纤维膜裁剪成0.3 cm×0.3 cm大小并镀金处理后，在10 kV加速电压条件下，采用SU8010型场发射扫描电子显微镜(SEM，日本Hitachi公司)观察纳米纤维的微观形貌。从SEM图中随机选取100根纳米纤维，利用Imagplus软件测量纤维直径，统计纤维的直径分布情况。

1.5 傅里叶红外光谱测试

采用VERTEX 70型傅里叶变换红外光谱分析仪(德国Bruker公司)对纳米纤维膜进行傅里叶变换红外光谱分析(FTIR)，扫描范围为4 500～250 cm-1。

1.6 水接触角测试

将纳米纤维膜试样裁剪成3.0 cm×3.0 cm大小，将5 μL去离子水滴在纳米纤维膜表面，采用DCAT 21型水接触角分析仪(德国 Dataphysics公司)观察并记录相同时间间隔下不同纳米纤维膜接触角的变化情况。

1.7 力学性能测试

在室温下，采用YG(B) 026P型电子单纤维强力仪(温州大荣纺织仪器有限公司)对纳米纤维膜的力学性能进行测试。将纳米纤维膜裁剪成3.0 cm×0.5 cm的长方形带状，以10 mm/min的拉伸速率将纤维膜拉伸至断裂并记录数据。纳米纤维膜的拉伸强度按式(1)计算。

(1)

式中：T——试样的拉伸强度，MPa；

F——试样拉伸过程中的最大载荷，N；

S——试样横截面面积，mm2。

1.8 抗氧化性能测试

采用DPPH自由基清除法对复合纳米纤维膜的抗氧化性能进行测试。清除率越高，抗氧化性能越好。制备0.2 mg/mL的DPPH乙醇溶液，避光保存备用。称取适量的PPE，制备质量分数为3%、6%和9%的PPE乙醇溶液。分别称取25 mg PCL、 PCL/3PPE、PCL/6PPE和PCL/9PPE纳米纤维膜，切成小块浸泡于3 mL无水乙醇中，制备纳米纤维膜样品溶液。分别取2 mL纤维膜样品溶液与2 mL的DPPH溶液混合后，用紫外分光光度计于517 nm处检测吸光度(OD值)。DPPH自由基清除率(k)按式(2)计算。

(2)

式中：A0——无水乙醇与DPPH的OD值，作为空白组；

Ax，0——待测液与无水乙醇的OD值；

Ax——待测液与DPPH的OD值。

1.9 体外抗菌活性

利用圆盘扩散法检测PPE纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠埃希(E.coli)及白色念珠菌(C.albicans)的体外抗菌活性。将纳米纤维膜裁剪成1.0 cm ×1.0 cm大小的正方形，紫外灭菌后，将其分别放置于涂覆有S.aureus、E.coli及C.albicans的平皿中，于培养箱中(S.aureus、E.coli的培养温度为37 ℃，C.albicans的培养温度为28 ℃)培养24 h后，观察并记录抑菌圈直径。重复试验3次，结果取平均值。

1.10 统计分析

采用GraphPad Prisim 5.0软件对试验结果进行分析处理，利用单因素方差法对抗菌结果进行统计分析。当P<0.05 时，认为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 场发射扫描电镜分析

不同PCL/PPE复合纳米纤维膜的SEM图及纤维直径分布如图1所示。SEM图显示，PCL/3PPE、PCL/6PPE和PCL/9PPE复合纳米纤维膜均呈三维网格结构交错排列，纤维表面光滑连续，无明显串珠形成，与空白对照组(PCL纳米纤维膜)形态相似。PCL纳米纤维膜的纤维平均直径为(96.88±12.02)nm。复合纳米纤维膜的纤维直径随着PPE质量分数的增加而逐渐增大，当PPE的质量分数为9%时，PCL/9PPE复合纳米纤维膜的纤维平均直径最大，为(415.62±16.50)nm。原因可能是随着复合纳米纤维膜中PPE质量分数的增加，纺丝液的黏度不断增大，电导率降低，导致纺丝过程中纺丝液不易于分散，进而造成PCL/PPE复合纳米纤维直径增大[13-14]。

图1 纳米纤维膜的SEM图及纤维直径分布图

2.2 傅里叶变换红外光谱分析

为证实PPE已负载至复合纳米纤维膜中，对纤维膜进行FTIR分析。PPE和不同纳米纤维膜的傅里叶变换红外光谱图如图2所示。图2中，3 352 cm-1处为PPE中多酚类物质—OH的特征吸收峰,1 733 cm-1处为PCL中羰基的特征吸收峰，2 954 cm-1是—CH2的非对称伸缩振动峰，2 874 cm-1处是—CH2的对称伸缩振动峰，1 067 cm-1处为C—O的伸缩振动峰，1 260 cm-1处为C—O—C 的非对称伸缩振动峰。PCL/3PPE、PCL/6PPE和PCL/9PPE纳米纤维膜的FITR光谱图上均出现了PCL的特征峰。与PCL纳米纤维膜的特征峰相比，PCL/PPE复合纳米纤维膜在3 352 cm-1处出现了新的特征峰，这可能是PPE中多酚类物质—OH的振动引起的，且该峰值随着复合纳米纤维膜中PPE质量分数的增加而逐渐增大。此外，复合纳米纤维中的PCL特征峰出现了略微偏移的情况，这可能是由于PPE中的酚羟基与PCL中的羰基间形成了氢键，使羰基电子云密度平均化，从而导致伸缩振动频率降低。

2.3 水接触角测试

理想的伤口敷料应具有良好的吸水性[15]。因此，对纳米纤维膜的亲水性进行了测试。不同纳米纤维膜的水接触角测试结果如图3所示。由图3可以看出，随着PPE质量分数的增加，纳米纤维膜表面的水接触角逐渐减小，接触10 s时，PCL、PCL/3PPE、PCL/6PPE与PCL/9PPE 纳米纤维膜的水接触角分别为134.00°±0.60°、12.95°±0.93°、10.93°±9.28°和10.00°±0.20°。当纳米纤维膜的水接触角小于90°时，可认为该材料为亲水性材料[16]，并且水接触角越小，亲水性越好。据此结合图3可知，复合纳米纤维膜中PPE质量分数与纳米纤维膜的亲水性成正相关。这可能是因为PPE中富含酚羟基等极性基团，其亲水性远高于PCL等合成高分子材料[17]。PPE与纺丝基质结合后，提高了复合纳米纤维膜的亲水性。

A——PPE；B——PCL；C——PCL/3PPE;D——PCL/6PPE；E——PCL/9PPE。图2 PPE与纳米纤维膜的红外光谱图

图3 纳米纤维膜在与水接触1、5和10 s时的接触角

2.4 力学性能测试

理想的伤口敷料应具备与人体皮肤相匹配的力学性能，以防伤口皮肤受拉伸引起二次损伤。4种纳米纤维膜的力学性能测试结果见表1。由表1可以看出，添加PPE后所得纳米纤维膜的力学性能提高。PCL纳米纤维膜的拉伸断裂强力和断裂伸长率分别为(1.11±0.02)MPa和(23.25±0.70)%。随着复合纳米纤维膜中PPE的质量分数由3% 增加至9%，复合纳米纤维膜的拉伸强力逐渐增大，由PCL/3PPE的(4.06±0.03)MPa增加至PCL/9PPE的(10.17±0.12)MPa。原因可能是PPE中多酚类化合物的酚羟基与PCL的羰基氧原子结合形成了氢键[18]。此外，PCL/9PPE复合纳米纤维膜的弹性模量高达(51.90±5.38)MPa，而人体皮肤的弹性模量为5～150 MPa[19]。复合纳米纤维膜的弹性模量在人体皮肤的弹性模量范围内，具有与人体皮肤相似的弹性模量。

表1 纳米纤维膜的力学性能测试结果

2.5 抗氧化性能测试

伤口愈合的炎症阶段会产生大量的氧化自由基，通过消除或减少自由基的数量可提高巨噬细胞对死细胞的清除能力，缩短伤口愈合的时间[20]。不同材料对DPPH自由基的清除率测试结果如图4所示。由图4可知，PPE溶液对DPPH自由基表现出较强的清除能力，当溶液中PPE的质量分数为9%时，PPE对自由基的清除率高达(83.00±0.85)%，明显高于相应PPE质量分数的复合纳米纤维膜(PCL/9PPE)和PCL纳米纤维膜对照组。原因可能是纺丝过程中有部分PPE损失，导致PCL/PPE复合纳米纤维膜的抗氧化性降低。与对照组PCL纳米纤维膜的DPPH自由基清除率(11.77±0.92)%相比，随着PPE质量分数的增加，PCL/PPE复合纳米纤维膜对DPPH自由基的清除效果显著增强，PCL/9PPE纳米纤维膜对DPPH自由基的清除率高达(71.47±0.28)%。原因可能是复合纳米纤维膜中释放的PPE与DPPH自由基发生了氧化还原反应[21]。

*** 表示P<0.01。图4 DPPH自由基清除率

2.6 体外抗菌活性

理想的伤口敷料除了具备减轻伤口处的炎症反应，吸收伤口渗出液的功能外，还应具有一定的抗菌性[22]。S.aureus、E.coli与C.albicans是导致伤口感染的常见病原体[23-24]。4种纳米纤维膜的抗菌性能测试结果如图5和表2所示。由表2可以看出，对照组PCL 纳米纤维膜无明显的抑菌效果。与对照组相比，随着PCL/PPE复合纳米纤维膜中PPE质量分数的增加，对S.aureus、E.coli与C.albicans的抗菌效果显著增强，PCL/9PPE与PCL/6PPE复合纳米纤维膜对S.aureus的抗菌效果无显著性差异，PCL/9PPE复合纳米纤维膜对S.aureus、E.coli与C.albicans的抑菌圈直径分别高达(29.47±1.29)、(19.83±0.46)和(16.39±1.40)mm，明显高于对照组PCL纳米纤维膜和PCL/3PPE试验组。此外，PCL/PPE复合纳米纤维膜对S.aureus和E.coli的抗菌效果均优于C.albicans，原因可能是C.albicans的细胞壁上含有油脂类成分，不利于对亲水性PPE的吸收[25]。PCL/PPE复合纳米纤维膜对E.coli的抗菌效果不及对S.aureus的抗菌效果，原因可能是E.coli为革兰氏阴性菌，其细胞壁中的肽聚糖、磷脂层和脂多糖层等复杂结构，能够阻止部分PPE进入其细胞内部[26]，减少了PPE对细胞内部结构的破坏。体外抗菌活性测试结果表明，PPE已成功复合至PCL纤维基质中，使复合纳米纤维膜具备抗菌性能。

*** 表示P< 0.01；** 表示 P<0.05；ns表示P>0.05。图5 纳米纤维膜的体外抗菌效果

表2 纳米纤维膜的抑菌效果对比

3 结论

本文向PCL溶液中加入不同质量分数的PPE，再通过静电纺丝技术成功制备PCL/PPE复合纳米纤维膜和纯PCL纳米纤维膜，并对纤维膜的物理和化学性能进行测试与对比分析。研究结果表明，PCL/PPE复合纳米纤维膜表现出良好的力学性能、亲水性和抗氧化性等性能。此外，PCL/PPE复合纳米纤维膜对S.aureus、E.coli和C.albicans具有明显的抗菌效果。这种PCL/PPE复合纳米纤维在伤口敷料领域具有潜在的应用前景。