组织离体时间对乳腺癌ER、PR、HER-2、Ki-67染色表达的影响

范柳倩，孟洁琼，程国平

浸润型原发性乳腺癌中ER、PR、Ki-67增殖指数和HER-2，是最显著的预后相关预测因素。同时，能有效指导治疗[1]。ER阳性患者可从内分泌治疗中受益，PR也具有类似的指导作用。有研究报道15%～20%乳腺癌中HER-2过表达，其表达与较高的复发率和病死率相关。Ki-67增殖指数是乳腺组织中肿瘤细胞的主要参考检查之一。组织样本处置是分析前阶段的关键影响变量，根据美国临床肿瘤学协会(ASCO)及美国病理医师学院(CAP)的相关指南进行操作[2]。目前，临床相关指南建议乳腺癌切除样本应尽可能在短时间内固定，离体时间应低于1 h，但离体时间过长对ER、PR、HER-2等免疫组化染色结果的影响相关报道仍较少。本科室经过多年摸索，总结了组织离体时间对乳腺癌免疫组化染色重要标志物的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2020年6月～2021年10月来我院就诊且接受手术的8例乳腺癌组织。纳入标准：(1)明确诊断乳腺癌且接受手术切除治疗；(2)术中可获得足够组织样本用于实验分析。排除标准：(1)患者接受新辅助化疗；(2)有既往乳腺手术史；(3)免疫组化染色失败。

1.2 组织样本处理每例标本根据不同离体时间(0、0.5、1、2、4、24、48 h)及室温下和4 ℃冰箱保存，分为14个组织，合计112个标本。标本均经10%中性福尔马林固定8～48 h，按常规行组织处理，包埋，3 μm厚连续切片。行HE染色，采用免疫组化检测ER、PR、HER-2和Ki-67的表达。载玻片上未染色的组织切片于干燥箱内加热1 h，干燥温度为60 ℃。ER评估采用单克隆抗体SP1(Ventana, Tucson, AZ)；使用单克隆抗体1E2(Ventana)评估PR；4B5抗体(Ventana)对HER-2进行分析，Ki-67采用MIB-1单克隆抗体进行检测。本实验均使用Ventana BenchMark XT在自动模式对切片进行染色，染色结果均由同一位临床经验丰富的病理医师进行评分。

1.3 结果判断激素受体通过ASCO/CAP标准进行定性评分[3]，即对ER和PR肿瘤细胞≥1%为阳性；两者定量评分采用H评分法。将阳性细胞染色百分比与染色强度两者相乘，其中无着色为0分，弱着色为1分，中等着色为2分，强着色为3分；总分为0～300，0表示肿瘤中无染色，300分表示肿瘤组织呈弥漫强染色。HER-2评分分为阴性(0、1+)、不确定(2+)、阳性(3+)。Ki-67评分为免疫染色细胞核数量占总肿瘤细胞核数量的百分比，计数在切片的3个随机选择区域内进行(400×)，评分范围0～100%。文献报道其表达值分为：低(<15%)、中(16%～30%)和高(>30%)三类。本实验将HER-2与Ki-67的三个等级结果亦表示为强度等级以便于统计分析，相同抗体染色的0 h(对照)由同一位病理医师重新进行回顾和评分，冲洗时间间隔为数小时，若随着时间间隔延长染色减少始终存在，则确认存在染色减少；若仅在特定时间段内出现局灶性的减少，则认为是由于肿瘤样本的异质性造成。

2 结果

2.1 室温环境下不同离体时间对免疫组化染色的影响术中切除的组织样本均分为室温下及4 ℃冰箱冷藏保存。室温下不同标志物随不同离体时间延长相应H评分的变化：0 h样本中HER-2、ER、PR、Ki-67的H评分的平均值与中位数分别为180(150)、210(102)、132(105)、106(100)，各个标志物H评分均呈逐渐降低趋势，4、24、48 h与0 h相比差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2 4 ℃环境下不同离体时间对免疫组化染色的影响不同标志物随离体时间延长亦出现染色逐渐减少的趋势变化。

表1 常温条件下不同标志物随组织离体时间延长H评分变化[平均值(中位数)]

虽然冷藏样本中平均H评分与0 h相比差异无显著性，但自4 h起平均H评分逐渐降低。与室温下的染色变化对比，离体时间自2、4、24、48 h差异有显著性(P均<0.05)，即4 ℃冷藏环境中的染色强度表达降低幅度更低(表2)。

2.3 染色变化定性分析定性分析用于查看是否有样本自阳性转为阴性。本组各个标志物在室温和冷藏下不同离体时间相应染色强度等级的阳性率变化统计，各标志物中室温下逐渐降低的趋势明显高于冷藏条件。冷藏样本与室温下转为阴性的组织样本分别为4、7例，但差异无显著性(P=0.341，图1)。

图1 各标志物染色表达的定性分析：A.HER-2在不同离体时间、不同保存条件染色强度的对比；B.ER在不同离体时间、不同保存条件染色强度的对比；C.PR在不同离体时间、不同保存条件染色强度的对比；D.Ki-67(MIB-1)在不同离体时间、不同保存条件染色强度的对比

表2 4 ℃环境下不同标志物随组织离体时间延长H评分变化[平均值(中位数)]

3 讨论

激素受体的表达是乳腺癌中最重要的生物学标志物，且是最佳个体治疗决策的基石。病理诊断术中切除的组织由于血流中断不稳定、大分子的活性逐渐丧失，导致组织缺血、缺氧、酸中毒和酶降解，该过程受离体时间长短的影响[4-5]。虽然组织缺血、缺氧、酸中毒和酶降解无法控制，但可通过适当的标本处理来控制组织离体时间。标准离体时间即组织切除至福尔马林固定组织渗透的时间，是确定ER、PR等标志物表达的重要步骤[6-7]。本实验旨在探讨不同离体时间对浸润型乳腺癌样本生物学标志物表达水平检测结果的影响，实验发现室温条件下不同标志物随离体时间延长亦出现染色逐渐减少的变化；而各标志物在冷藏条件下，不同离体时间相应染色强度等级的阳性率降低的趋势明显低于室温条件。由此可见，不同离体时间、不同的储存条件对于组织染色强度的影响较大。

目前，由福尔马林固定延迟引起的长时间肿瘤缺血可导致标志物表达降低。有学者将改良根治性乳腺切除组织样本中ER、PR蛋白水平，与核心针活检结果进行比较，结果显示核心针活检标本中肿瘤激素受体蛋白表达实验有缺陷，作者认为组织样本的延迟固定可能是最主要的原因。本组以组织离体时间0 h作为对照组，更具有研究价值和代表性。因此，对于激素治疗的患者，妥善的组织样本管理至关重要[8]。文献报道福尔马林固定前，于室温下将标本分别保持不同时间段，发现ER表达在2 h后下降，离体时间1 h后PR表达开始下降，离体时间8 h后ER不表达；4 ℃下过夜处理亦出现类似结果。因此，建议组织样本获得后尽可能1 h内进行固定[9]。本实验亦显示随着组织离体时间的延长，激素受体的表达水平普遍降低，提高激素受体和HER-2检测的准确性，改善其作为乳腺癌标志物预测患者临床预后的效能还具有挑战性，但随着离体时间的延长，乳腺癌相关标志物的有效检测率均出现明显降低。因此，应将组织离体时间最小化，以做到对组织样本的妥善评价[10-11]。组织染色中环境、温度亦起到显著影响，室温与冰箱冷藏温度相比，对乳腺癌的预测因子病理检查影响更为显著[12-13]，与本组结果基本一致。

综上所述，与冰箱内4 ℃固定标本相比，室温下标本受组织离体时间(≤2 h)的影响更大。临床实践中需遵循ASCO/CAP指南<1 h的建议，将组织离体时间尽可能缩短。