维多利亚蓝弹性纤维染色常见问题分析与质量控制

虞文伟，张顺民，郑建明，唐 峰，冼志红

特殊染色技术在日常病理诊断中具有重要意义[1-2]，弹性纤维染色对评估疾病组织中弹性纤维变化、恶性肿瘤的血管侵犯及某些肿瘤的鉴别诊断有重要价值[3-4]。经典的Verhoeff弹性纤维染色法只能显示粗大的弹性纤维[5]；维多利亚蓝弹性纤维染色步骤相对较少，可显示细小弹性纤维，颜色清新；与Van-Gieson复染组合，可对结缔组织成分做出良好的评估。为了普及和提高该染色技术，上海市临床病理专科委员会联合上海市临床病理质量控制中心，对上海市50家医院病理科进行了维多利亚蓝弹性纤维染色技术室间质量控制测评。本文对测评中出现的染色缺陷的关键问题进行分析，并探讨其主要原因及解决方案，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2021年5月上海交通大学附属新华医院病理科肺肿瘤切除标本，选择5例含有胸膜和肺腺癌的代表性蜡块，由上海医学会病理分会技术组专家制作特殊染色比赛切片。

1.2 方法

1.2.1切片 标本均经10%中性福尔马林固定，常规取材，组织脱水，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行HE染色。将5例石蜡标本切片分发至各参评单位，行维多利亚蓝弹性纤维染色。

1.2.2试剂 (1)高锰酸钾溶液；(2)草酸溶液；(3)弹性纤维染液；(4)Van-Gieson染液。试剂经2～8 ℃冰箱保存待用，维多利亚蓝弹性纤维染色液购自贝索生物公司。

1.2.3染色步骤 (1)石蜡切片常规脱蜡至水；(2)高锰酸钾溶液氧化5 min，稍水洗；(3)草酸溶液漂白2～3 min至切片无色为止，细流水冲洗；(4)95%乙醇稍洗，浸入弹性纤维染液中常温作用8～24 h(加盖，避免染液挥发)；(5)95%乙醇或1%盐酸乙醇分化，快速浸洗至无多余染液脱下(必要时镜下控制，避免脱色过度)；(6)细流水冲洗3～5 min；(7)用Van-Gieson染液复染1 min，倾去染液，不可经水洗；(8)95%乙醇快速分化数秒，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3 结果判断高倍镜下切片弹性纤维染色呈蓝黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色。

1.4 质控评分评分标准预先由专家委员会制定，经两位主任医师阅片并按标准评分(表1)。本次质控着重对染色质量进行评分，不包括前期组织处理、组织切片及染色后封固质量。评分结果按下列分数定级：甲级片≥90分(优)，乙级片：75～89分(良)，丙级片：60～74分(基本合格)，丁级片：<60(不合格)。

表1 维多利亚蓝弹性纤维染色评分标准

2 结果

本次室间质量控制测评，切片合计50张，有48家单位提交染色切片。根据两位专家的评分结果，其中甲级片14张，乙级片26张，丙级片5张，丁级片3张(表2)。

优良染色的切片定位准确，染色强度恰当，无非特异性着色，各种染色对比清晰。弹性纤维染色呈蓝黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维和红细胞呈黄色(图1)。可清楚显示肺组织内动脉管壁的弹性纤维，呈蓝色，较细、呈波浪状断续曲折，并可显示损伤的动脉管壁的弹性纤维变性、断裂和缺失(图2)。正常肺泡中弹性纤维沿肺泡勾勒出肺泡的大体轮廓(图3)；可清楚地判断肺癌细胞与脏层胸膜的关系。肺癌累及胸膜时，弹性纤维膜断裂并显著减少(图4)。

常见的染色缺陷：(1)弹性纤维淡染，与细胞质对比差(图5)；(2)弹性纤维染色过深而模糊，细胞胞质呈灰蓝色(图6)；(3)胶原蛋白呈错误的染色或染色不均匀，如胶原蛋白未着色或整个切片染成蓝色等假象(图7)；(4)肌肉和红细胞未染色或灰色，而不是黄色(表2，图8)。

表2 维多利亚蓝弹性纤维染色效果

3 讨论

3.1 染色机制弹性纤维染色的主要机制是带负电荷的弹性蛋白(含二硫键及酸性基团)，与带有弱正电荷的染料通过非极性吸附完成染色。维多利亚蓝弹性纤维染液是维多利亚蓝、间苯二酚染料与三氯化铁络合，形成维多利亚蓝-铁-间苯二酚色淀。这种复合物的酚基与弹性纤维的某些成分之间形成氢键，将弹性纤维染成蓝黑色，Van-Gieson染色为对比染色。

维多利亚蓝弹性纤维染色可能与以下因素有关：(1)高锰酸钾氧化后，部分二硫键转化为阴离子的硫酸衍生物，呈强嗜碱性，对染液中的碱性染料具有相对选择性。高锰酸钾、草酸处理可增强染色的对比度和深度，氧化时间过长可导致非特异性染色。(2)维多利亚蓝成分多样，可影响弹性纤维的着色；三氯化铁含有亚铁盐也可干扰染色结果。(3)盐酸-乙醇分化是决定染色成败的关键步骤，分化过度细纤维很容易消失。(4)Van-Gieson液的苦味酸如果不饱和，胶原、细胞质和肌肉会染上淡粉色到淡橙色，高pH值胶原的选择性染色减弱。

3.2 染色缺陷及解决方案本次室间质量控制评价结果显示，66.7%的染色切片弹性纤维定位准确，染色强度恰当，无非特异性着色，对比清晰，但也存在一些染色缺陷。(1)弹性纤维染色过浅、与背景对比差：可能与弹性纤维染液制备不当、染液过旧、不同批号的维多利亚蓝及染液中氯化铁有杂质相关。解决方案：应按正确顺序制备弹性纤维染液、使用经过认证的染料、维多利亚蓝4R效果较好，在镜下检查切片分化程度，过度分化可重新染色切片。(2)弹性纤维染色过深、背景呈蓝灰色：主要原因是切片脱色不足，应延长在乙醇或盐酸-乙醇溶液中的分化时间，并在镜下检查分化程度。(3)胶原、肌肉和红细胞未染色或呈灰蓝色：主要原因包括Van-Gieson染色试剂陈旧或多次使用，苦味酸未饱和，弹性纤维分化不够；应及时更换试剂，确保Van-Gieson染色剂中苦味酸的饱和性和适当的弹性纤维分化。(4)组织结构成分出现错误的颜色或染色不均匀：主要原因包括组织固定不充分、染色分化不当、染色液pH值不正确；应更换固定良好的组织块，正确的分化并验证染液的pH值为2.5或更低。

①②③④⑤⑥⑦⑧图1 弹性纤维染色呈蓝黑色,胶原纤维呈红色,肌纤维和红细胞呈黄色,维多利亚蓝弹性纤维染色法 图2 肺组织内动脉管壁的弹性纤维呈蓝色,损伤的动脉管壁的弹性纤维变性、断裂和缺失,维多利亚蓝弹性纤维染色法 图3 正常肺泡中弹性纤维沿肺泡勾勒出肺泡的大体轮廓,维多利亚蓝弹性纤维染色法 图4 肺癌累及胸膜,弹性纤维膜断裂并显著减少,维多

3.3 维多利亚蓝弹性纤维染色质量控制影响弹性纤维染色结果的因素包括氧化时间、染料纯度和溶液pH值、染色和分化时间等[6]。设置阳性对照切片最为关键，使用组织芯片与待检测组织在同一张切片上进行染色。最好使用较小的肌性动脉，因为显示肌壁内的细弹性纤维可更好地确定分化终点，管壁平滑肌黄色；血管周胶原纤维红色。全自动特殊染色已应用于日常工作，为染色条件的一致性、结果的准确性和可靠性提供保证。

综上所述，弹性纤维染色影响因素较多，操作流程中应严格掌握和控制染色温度、染色时间、pH值、试剂配制及保存等细节，规范化操作，做好质控，以保证染色的稳定性和可靠性，更好地服务于临床病理诊断。