甜茶饮片质量标准研究

张筱萱，卿丽婷，吴家超，蒋 林，2，林青华，2*

(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200；2.广西中医药大学广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200)

甜茶为蔷薇科植物甜叶悬钩子RubussuavissimusS.Lee的干燥叶，可清热、润肺、祛痰、止咳[1-2]，是广西特有的集药、茶、糖于一体的药食同源类植物，开发前景广阔[3]。“甜茶”的同名异物品种众多，其中广西将可代茶饮的甜味植物均称为“甜茶”，上海、浙江、江苏、湖北、江西将虎耳草科植物伞形绣球、伞花绣球、腊莲绣球和菊科植物甜叶菊的干燥叶也称为“甜茶”[4]，本研究所指甜茶均为蔷薇科植物甜叶悬钩子的干燥叶。甜茶药材在广西[1-2]、贵州[5]的药材质量标准中有所收载，相关质量标准的研究虽有文献报道[6-7]，但饮片才是供临床调剂及中成药生产的配方原料[8]，而甜茶饮片的质量标准却未在《中国药典》及各省(区)、市炮制规范中收载，也未见甜茶饮片质量标准的文献报道。甜茶饮片质量标准的缺失不利于其质量控制和产品开发，故亟需建立甜茶饮片的质量标准，以保障临床应用及中成药生产等方面的质量要求。故本研究参照2020年版《中国药典》(四部)附录的相关内容，对甜茶饮片进行定性鉴定和定量研究，以期为建立甜茶饮片的质量标准提供参考及依据。

1 材料

1.1 药材

甜茶药材来源(经广西中医药大学药用植物教研室朱意麟老师鉴定为蔷薇科植物甜叶悬钩子RubussuavissimusS.Lee的干燥叶)见表1；甜茶苷对照品(纯度>98.0%，批号：MUST-19070201，中国科学院成都生物研究所)。

表1 10批甜茶药材编号与来源

1.2 仪器与试剂

Agilent-1260高效液相色谱仪(Agilent公司)，Ultimate©XB-C18色谱柱(月旭科技)；色谱级乙腈(Thermo Fisher Scientific)，Direct-Q5UV型超纯水仪一体机(广西南宁博美生物科技有限公司)；DMB-1223型生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)，硅胶G板(青岛海洋化工有限公司)，甲醇、甲苯、甲酸、乙酸乙酯、水合氯醛、丙三醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

不同产地的10批甜茶药材常水软化、切丝、干燥；参照《中国药典》“药材和饮片检定方法”对甜茶饮片进行描述。甜茶饮片的性状特征呈丝片状。上表面呈深棕色或黄绿色，较光滑，下表面呈灰棕或浅绿色；上表面主脉明显，下表面主脉和侧脉凸出，网脉明显，边缘平滑或具小锯齿。近革质，质脆，气微，味甜。

2.2 显微鉴别

参照《中国药典》“显微鉴别法”进行甜茶饮片粉末的显微鉴别。甜茶饮片的显微鉴别特征为：甜茶粉末呈黄绿色或棕褐色。表皮细胞类圆形或类方形，可见不定式气孔。非腺毛较多，单细胞，散在，多碎断，完整者基部细胞粗短膨大，壁较厚，有疣状突起，长85～175 μm。薄壁细胞内含草酸钙簇晶，常排列成行，也有的单个散在，直径8～18 μm。可见螺纹或环纹导管，以螺纹导管为主，常见于叶肉细胞中。偶见棕色块，类圆形，颜色深浅不一。见图1。

注：1.表皮细胞；2.非腺毛；3.栅栏组织；4.草酸钙蔟晶；5.导管；6.棕色块。

2.3 薄层色谱鉴别

取甜茶饮片粗粉1 g，加10 mL甲醇，超声处理0.5 h后滤取滤液，蒸干，加2 mL甲醇复溶，即得供试品溶液；称取甜茶苷对照品适量加甲醇溶解(0.1 mg/mL)，即得对照品溶液。参照《中国药典》“薄层色谱法”，分别吸取对照品溶液、供试品溶液各5 μL点于同一硅胶G薄层板(预先于105 ℃活化30 min)上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶4∶0.9)为展开剂进行展开，取出，晾干后喷10% 硫酸乙醇溶液显色。结果发现，供试品与对照品在硅胶G板的相应位置上，显相同颜色的斑点。见图2。

2.4 水分、灰分和浸出物测定

分别参照《中国药典》“水分测定法(烘干法)”“灰分测定法”和“浸出物测定法(水溶性浸出物，热浸法)”进行甜茶饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物测定。结果表明，10批甜茶饮片的水分、总灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的含量分别为9.52%～11.72%、4.63%～5.61%、0.07%～0.19%和36.27%～39.02%，见表2。根据上限值上浮20%、下限值下浮20%的原则[9-10]，拟定甜茶饮片的水分、总灰分和酸不溶性灰分的含量分别不得高于14.0%、7.0%和0.23%，水溶性浸出物的含量不得低于29.0%。

图2 甜茶饮片供试品(1～10)与甜茶苷对照品(T)在日光下的薄层色谱

表2 甜茶饮片中水分、总灰分、酸不溶性灰分与水溶性浸出物含量 (%)

2.5 甜茶苷含量测定

2.5.1 对照品溶液制备 取甜茶苷适量，精密称定，加50%乙醇制成每1 mL含甜茶苷1 mg的溶液，即得对照品溶液。

2.5.2 供试品溶液制备 取甜茶饮片粉末(过五号筛)约0.5 g，精密称定，置离心管中，精密加50%乙醇25 mL，盖紧并用封口膜封严，超声处理1 h，放冷，离心(3 500 r/min，10 min)，小心倾取上清液，残渣再按上述方法提取1次，合并两次提取液，摇匀，取续滤液，即得供试品溶液。

2.5.3 色谱条件 色谱柱：Ultimate©XB-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流动相：乙腈- 0.1%磷酸水溶液(35∶65)；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；波长：205 nm。对照品与供试品的HPLC图，见图3。

2.5.4 线性关系考察 精密吸取“2.5.1”项下对照品溶液1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、10 mL，置于不同的10 mL容量瓶中，加50%乙醇定容，制成系列浓度的对照品溶液，摇匀，取续滤液进样并记录峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，以对照品浓度为横坐标(X)，得回归方程Y=8 211.100 93X+25.068 36，r=0.999 9，说明甜茶苷对照品在1 011.0～101.1 μg/mL的浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

2.5.5 方法学考察 精密吸取“2.5.4”项下同一对照品溶液连续进样6次，以峰面积计算甜茶苷对照品的RSD为0.06%，说明仪器精密度良好；取同一份甜茶饮片样品，按“2.5.2”项下方法平行制备6份供试品，按“2.5.3”项下色谱条件进样，按峰面积计算甜茶苷的RSD为1.93%，说明供试品制备方法重现性良好；取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h依次进样，以峰面积计算甜茶苷对照品的RSD为0.27%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好；取已知含量的甜茶饮片样品6份，分别加入相同量的甜茶苷对照品，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱方法进样，计算甜茶饮片中甜茶苷的平均回收率及RSD分别为101.57%和0.66%，说明“2.5.2”项下供试品的制备方法能将甜茶饮片中甜茶苷提取完全，满足含量测定的要求。

2.5.6 样品含量测定 10批甜茶饮片进样分析，结果表明，其甜茶苷含量为3.06%～5.13%。根据甜茶苷含量下限值的80%制订限量标准，拟定甜茶饮片中甜茶苷的含量不得低于2.5%。

3 讨论

甜茶苷，又名甜茶素、甜叶悬钩子苷，是甜茶的主要甜味成分，其甜度高、热量低，具有降血压、降血糖等多种作用，在食品、医药行业极具开发价值[11]。因此，本研究选用甜茶苷作为对照品，对甜茶饮片进行薄层定性鉴定和HPLC含量检测。

3.1 薄层鉴别

本实验在参考甜茶药材质量标准[5]及其研究报道[7]的基础上，考察了多种展开系统(氯仿-甲醇-水、正丁醇-乙酸-水、环己烷-乙酸乙酯、甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸)对供试品和对照品的展开效果。结果发现，甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6∶4∶4∶0.9)为展开剂时，供试品、对照品在硅胶G薄层板上的分离效果好,斑点清晰不拖尾,且Rf值适中。此外，有学者在甜茶药材质量标准研究过程中将金丝桃苷、芦丁作为对照品进行薄层鉴别[6]，但两者在中药饮片中广泛存在，专属性差，故本实验在甜茶饮片薄层鉴别中对金丝桃苷、芦丁未予考虑。

图3 50%乙醇(A)、甜茶苷对照品(B)与甜茶饮片供试品(C)在205 nm处的HPLC

3.2 含量测定

甜茶苷的含量测定方法文献报道较多[7，12-17]，为优选甜茶饮片中甜茶苷的含量测定方法提供了参考。但也存在方法陈旧[15]、甜茶苷出峰时间过早(tR<5 min)[12，14]或过晚(tR≈20 min)[17]等不足之处。目前，HPLC仍是药物含量测定的主流方法，故本研究在借鉴文献报道[7，13]的基础上，综合考虑甜茶苷的分离度与出峰时间，最终优选出以乙腈- 0.1%磷酸水溶液(35∶65)为流动相的HPLC条件，在该条件下甜茶苷分离度良好、出峰时间适中(见图3)，经方法学考察其能够满足甜茶饮片中甜茶苷含量测定的需求。此外，本实验亦对制备供试品的提取溶剂(甲醇、乙醇及其浓度)、料液比(50倍、100倍)、提取方法(超声法、回流法)、提取时间(0.5 h、1 h)、提取次数(1次、2次、3次)进行了考察。结果表明，甜茶饮片供试品的最佳制备方法为50倍量的50%乙醇超声法提取2次，每次1 h。由于提取液黏度大，在滤取药渣进行再次提取的过程中滤过困难，极易产生误差，故将样品置于离心管(50 mL为佳)中超声处理，以便后续离心，再次提取，但需考察50%乙醇对离心管的影响。

本研究建立的甜茶饮片定性、定量质量标准稳定、可靠，可用于甜茶饮片的质量控制。