分散固相萃取高效液相色谱法测定蔬菜中灭蝇胺残留

刘 兰，周培华，汤春甫，康绍英，周兴旺，袁列江

（湖南省产商品质量检验研究院，食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410017）

灭蝇胺又名环丙氨嗪，是一种高效、低毒的生态农药，对双翅目昆虫有非常强的选择性。该药具有触杀和胃毒作用，内吸传导性强、持效期长，但作用速度较慢。目前GB 2763—2021 食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量 规定：豆角、芹菜、黄瓜和杧果中灭蝇胺最大残留限量值分别为0.5、4、1 mg/kg，人体每日允许摄入量为0.06 mg/kg bw（体重）。目前，国内外文献资料报道的灭蝇胺测定方法有高效液相色谱法[1-4]和液相色谱串联质谱法[5-9]。这些方法多数采用强阳离子萃取柱或者是氨基固相萃取柱进行萃取，前处理耗时较长，且操作步骤多，易造成灭蝇胺的损失，导致检测结果偏差较大。加上灭蝇胺有别于其他酸性或中性农药，它是一种碱性药剂，不适宜采用多成分的农残检测方法进行检测。笔者研究还发现，当采取恒定比例的流动相进行高效液相色谱检测时，进样3～5 次以后就会有杂质残留在色谱柱内，干扰检测，而且高效液相色谱串联质谱法测定灭蝇胺时结果受基质效应影响较大[8]。国家标准GB/T 20769—2008 水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 中也注明该方法仅为定性测定，而且质谱检测的仪器在市县级基层的应用并不普遍。灭蝇胺作为一种低毒农药，主要用于防治蔬菜类的美洲斑潜蝇和潜叶蝇等农业害虫[2]，最大残留限量值较高，高效液相色谱法完全可以满足灭蝇胺的定性定量准确测定。

分散固相萃取是一种快速、经济、准确的食用农产品农残检测前处理方法，相对其他前处理方法具有一定的优势[10-11]。分散萃取剂乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）去除脂肪酸成分的效果较好，而十八烷基键合硅胶（C18）和石墨化炭黑（GCB）去除色素和维生素成分的能力较好，可以明显改善净化效果[12]。为了快速、简便、准确测定蔬菜中的灭蝇胺含量，笔者采用乙酸铵乙腈提取、分散固相萃取技术从改变流动相的配比及洗脱方式等方面优化了蔬菜中灭蝇胺的高效液相色谱检测方法，改良后的方法更加适用于蔬菜中灭蝇胺的检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

主要试剂有灭蝇胺（浓度100 μg/mL，安谱公司），乙腈（色谱纯，德国CNW Technologies），乙酸铵、无水硫酸镁、氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）。主要仪器有Agilent 1260 高效液相色谱（美国安捷伦）、Auto HG-24 全自动匀质机（深圳市新悦科技发展有限公司）、旋涡混合器（常州润华电器有限公司）、CM-1000 高速震荡器（东京理化器械株式会社）、Milli-Q超纯水器（德国Millipore）、EPPENDORF 5804R 台式高速冷冻离心机（德国艾本德）、GM300 样品研磨仪（德国莱驰）。净化材料为乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）、石墨化炭黑（GCB）（Agela Technologies 公司）和0.45 μm 尼龙滤膜（天津市富成达科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件优化（1）最佳检测波长：选择200～400 nm 波长范围进行扫描，从扫描目标峰顶点提取光谱图，以确定最佳检测波长。（2）洗脱方式：以乙腈∶水为流动相进行洗脱，设计恒定洗脱（乙腈∶水=97 ∶3）和梯度洗脱2 种方式，考察不同洗脱方式对检测结果的影响。（3）其他色谱条件。检测器：二极管阵列检测器；色谱柱：Athena NH2-RP（4.6 mm×250 mm，5 μm，德国CNW Technologies 公司）；流速1.0 mL/min；柱温35 ℃；进样量10 μL。

1.2.2 标准曲线的绘制灭蝇胺标准储备液的配制：准确吸取100 μg/mL 灭蝇胺对照品溶液1.00 mL 到10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释并定容到刻度，摇匀，得到10 μg/mL 标准储备液，于-20℃保存；分别精密量取适量的上述储备液，用乙腈配制成浓度分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/mL 的标准工作溶液。以色谱响应峰面积为纵坐标（y）、标准溶液浓度为横坐标（x）绘制标准曲线。

1.2.3 样品前处理优化参照文献[1]和农残标准检测方法NY/T 1725—2009、GB 23200.110—2018 和GB 23200.113—2018 的样品前处理方式制定该研究的样品前处理方法。具体步骤为：分别取经过组织捣碎机处理的豆角、芹菜和黄瓜样品各10 g（精确到0.01 g），加入10 mL 提取液（0.05 mol/L 乙酸铵与乙腈按体积比1 ∶4 混合制成）涡旋混匀提取10 min；加入1.0 g 无水硫酸镁，再震荡提取30 min，8 000 r/min离心3 min；准确吸取4.0 mL 上层有机相到10 mL 离心管，加入1.0 mL 乙腈，混匀；加入适量PSA 和C18 进行分散固相萃取，涡旋混匀净化1 min，10 000 r/min 离心5 min；直接吸取上清液约2 mL 过0.45 μm滤膜，滤液装于进样小瓶，待测。试验分别考察了PSA 和C18 的不同添加量（PSA 添加量为50、100、150、200、250 mg；C18 添 加 量 为15、30、45、60、75 mg）对萃取效果的影响。

1.2.4 方法验证和比较以未检出灭蝇胺的样品为空白基质，分别向空白基质中添加低、中、高不同含量水平的灭蝇胺标准品，再使用PSA、C18 分散固相萃取法提取，分别采用分散固相萃取高效液相色谱法和NY/T 1725—2009 标准方法进行测定，通过加标回收试验测定优化后方法的加标回收率和精密度，平行测定6 次，并比较2 种方法的优缺点。

1.2.5 实际样品检测对市场随机选取的豆角、芹菜和黄瓜各12 批次样品使用分散固相萃取高效液相色谱法进行灭蝇胺农药残留量测定。按公式（1）计算样品中灭蝇胺的含量。

式中，W为样品中灭蝇胺的含量（mg/kg）；C为测得样品的浓度（mg/mL）；V为提取液的体积（mL）；80%为提取液有机相含量；V1为提取液稀释前体积（mL）；m为样品质量（g）。

2 结果与分析

2.1 色谱条件

选择200～400 nm 范围的波长进行扫描，从扫描目标峰顶点提取的光谱图（图1）显示，灭蝇胺在215 nm 处具有最大吸收峰，因此将检测波长定为215 nm 对灭蝇胺进行定性鉴别及定量分析。NY/T 1725—2009 标准方法中高效液相色谱分析的流动相为恒定比例的乙腈水溶液（乙腈∶水=97 ∶3），从分离的效果和连续进样对后续检验的干扰来看，这种洗脱方式不适合连续进样，几次进样后，残留杂质峰会干扰后续进样的目标峰，影响结果的准确性以及后续样品的分析。

图1 灭蝇胺对照品及加标样品溶液目标峰最大吸收光谱图

通过多次摸索试验，优化了流动相的流速和配比，最终确定流动相配比及洗脱时间如表1 所示。当流动相以梯度洗脱方式进行检测时，可以连续批量进样，前后连续相邻样品之间的分析没有相互干扰，灭蝇胺的保留时间为9.520 min（图2），且在灭蝇胺标准品出峰前后没有其他色谱峰干扰，基线平稳，噪音较小，多次进样后，系统无污染，无杂质峰干扰等情况发生。

表1 流动相梯度洗脱程序

图2 空白样品（A）和灭蝇胺标准品（B）的液相色谱图

2.2 分散固相萃取净化条件的确定

由图3 可知，随着PSA 剂量的增加，目标物的回收率逐渐升高，而随着C18 剂量的增加，目标物的回收率降低，于是最终确定PSA 的添加量为200 mg、C18 的添加量为15 mg，混合后对样品进行分散固相萃取，其中色素较深的芹菜提取液在加入PSA、C18后，再加入了50 mg 的GCB 作为净化剂。采用优化后的前处理方法处理样品，其中黄瓜样品提取净化液和加标回收液的液相色谱图如图4 所示。

图3 分散固相萃取剂不同添加量的回收率

图4 黄瓜样品提取净化液（A）和加标回收液（B）的液相色谱图

2.3 线性范围、回归方程、检出限及定量限

由标准曲线（图5）可知，该方法的线性范围为0.05～1.0 μg/mL，回归方程为y=109.408 9x-0.560 7，相关系数为0.999 9。以空白样品出峰时信号比S/N=3计算方法的检出限，灭蝇胺的检出限为0.02 mg/kg；以空白样品出峰时信号比S/N=10 计算方法的定量限，定量限为0.05 mg/kg。

图5 标准曲线

2.4 加标回收率和精密性

由表2 可知，分散固相萃取高效液相色谱法的平均回收率为96.3%～103.0%，RSD 为0.96%～5.02%；标准方法的平均回收率为98.3%～109.7%，RSD 为0.95%～3.87%。

表2 分散固相萃取高效液相色谱法同标准方法比较3 种蔬菜中加标回收测定结果（n=6）

2.5 方法比较

以10 批次样品的检测为例，从结果的准确性、前处理的时间、色谱柱的重复进样需要维护冲洗的次数等方面对标准方法和分散固相萃取高效液相色谱法进行比较分析，结果如表3 所示。与标准方法相比，分散固相萃取高效液相色谱法改进的地方主要有：（1）前处理方法由固相萃取改为分散固相萃取净化的方法，减少了固相萃取和旋转蒸发的步骤和时间；（2）高效液相色谱方法流动相配比由恒比例改成了梯度洗脱，减少了色谱柱杂质残留的影响，不需要反复冲洗色谱柱，可以无限连续重复进样；（3）定量更准确，由标准方法的单点标样定量变成标曲定量。综合来看，改进后的分散固相萃取高效液相色谱法在测定蔬菜样品中灭蝇胺残留时具有非常明显的应用优势。

表3 2 种方法的比较分析

2.6 实际样品测定

如表4 所示，豆角中灭蝇胺的检出率较高，存在一定的不合格批次，可能是因为在种植过程中豆角易发生病虫害，防治药剂使用较广泛所致；在芹菜和黄瓜中灭蝇胺检出批次较少，且没有发现不合格批次，可能是因为芹菜和黄瓜种植过程中灭蝇胺使用较少。

表4 3 种蔬菜中灭蝇胺的测定结果

3 结 论

该研究建立了一种高效、简便、准确、经济、高通量的蔬菜中灭蝇胺农药残留量的分散固相萃取高效液相色谱测定方法。该方法的检出限为0.02 mg/kg，定量限为0.05 mg/kg，结合样品的限量值，改良后的方法完全可以满足国内外大、中、小城市蔬菜样品中灭蝇胺农药残留量的检测。前处理方法由繁琐耗时的固相萃取加旋转蒸发浓缩改良为高效简便的分散固相萃取方法；且改变了流动相的配比和洗脱方式，不需要反复冲洗维护色谱柱，使测定变得连续且具有可重复性；定量更加准确，由标准方法的单点标样定量变成了标曲定量。改进后的方法具有非常明显的实际应用优势，解决了食品检测行业灭蝇胺准确测定这一难题。在以后的研究中，可根据技术的进步加强相关食品检测标准的更新，同时注意加强方法适应范围的扩大。通过准确检测可以督促以灭蝇胺为防治药剂的种植户在蔬菜等农产品种植过程中更加规范地使用化学药剂，保证蔬菜等农产品度过农药间隔期再上市，提高种植者的社会责任意识，减少灭蝇胺农药的滥用。