Ang-2、MMP-9和miR-142-3p在脓毒症合并AKI中的表达及相关性研究

张琳 许序云 李永琦 夏加伟

脓毒症属于感染性疾病，是通过细菌等病原微生物的入侵导致感染的危重症。其主要表现为全身出现炎性反应，导致机体心、肺等各器官功能出现严重障碍[1,2]。脓毒症致病率高，病情凶险，救治难度大，使其死亡率逐步升高，高达30%～70%，对于人们的生命健康安全造成巨大威胁[3]。急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是脓毒症常见的合并症，而随着脓毒症病情严重程度的进一步发展，容易造成机体多处器官的衰竭[4,5]。依据临床所提供的数据显示，脓毒症患者一旦产生AKI，其预后效果不理想，致死率高[6]。因此，国内外众多医学专家和学者致力于脓毒症合并AKI的发病机制研究以及探寻全新的治疗方法。据相关研究显示，Ang-2、MMP-9、miR-142-3p在支气管脓毒症合并AKI中的表达出现异常[5]。本研究旨在探究Ang-2、MMP-9、miR-142-3p在脓毒症合并AKI中的表达以及相关性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年7月至2021年7月60例于我院进行收治的脓毒症合并AKI患者为研究对象，其中AKI组30例，非AKI组30例，按照病情严重程度可分为轻度7例、中度10例、重度13例。选取同期30例于我院进行体检的健康志愿者为对照组。本研究在研究过程中患者本人其家属均知晓，并获得我院伦理委员会批准。3组性别比、年龄、BMI、原发感染疾病、感染病原菌等一般资料，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 3组一般资料比较 n=30

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：符合中国医师协会急诊医师分会制定的脓毒症诊断标准[7],符合AKI诊断标准[8]，患者病历资料均齐全。

1.2.2 排除标准：①肾小球疾病、合并慢性肾脏病等疾病者；②脓毒症发生前即存在肾功能障碍者；③泌尿系统出现阻塞或感染者；④机体凝血功能出现异常者。

1.3 指标检测

1.3.1 酶联免疫吸附实验法检测Ang-2、MMP-9、SOD、MDA、T-AOC水平：对所有研究患者进行空腹抽取静脉血5 ml，标记酶标板、稀释标准品，设置标准、空白、检测孔，标准孔添加标准品，空白孔添加终止液、显色剂，检测孔添加血清标本及抗体，封膜并晃匀，37℃保温箱静置60 min后去膜清洗，将水分吸干后各孔添加显色剂并进行均匀摇晃，摇晃至显色后加入终止液，空白孔为基准，使用酶标分析仪(上海酶联生物科技科技有限公司，型号：ML-dr3518)450 nm处测吸光值，计算Ang-2、MMP-9、SOD、MDA、T-AOC水平。

1.3.2 RT-PCR法检测miR-142-3p表达：吸取250 μl血浆样本，加入750 μl Trizol试剂，混匀，提取总RNA，进行逆转录反应，反应条件:42℃ 60 min，25℃ 5 min，70℃ 5 min，将逆转录反应后产物cDNA，-20℃保存备用，将逆转录产物进行预扩增。取预扩增产物4 μl，按照TaqManPCR试剂盒说明进行PCR反应。miR-142-3p引物序列：前引物：5’-CGCCGTGTAGTGTTTCCTAC-3’，后引物：5’-CAGTG-CAGGGTCCGAGGT-3’。对每个样本做3个复孔，采用RT-PCR检测方法，记录每个荧光反应管中的荧光信号达到所设定的阈值，将原始数据取3次重复的平均值，计算miR-142-3p表达水平。

2 结果

2.1 3组Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达比较 与对照组和非AKI组比较，AKI组Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达高于对照组和非AKI组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达比较

2.2 不同病情脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达比较 脓毒症合并AKI患者的Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达在患者年龄和性别比较上，差异无统计学意义(P>0.05)；脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达与病情严重程度、APACHEⅡ评分、Scr水平有关。随病情严重程度、APACHEⅡ评分及Scr水平情况，Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达升高(P<0.05)。见表3。

表3 不同病情脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达比较

2.3 3组氧化应激指标比较 与对照组和非AKI组比较，AKI组SOD、T-AOC水平低于对照组和非AKI组，MDA水平高于对照组和非AKI组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 3组氧化应激指标比较

2.4 脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达与肾功能、氧化应激指标的相关性 脓毒症合并AKI患者Ang-2表达与Cys-C、MDA水平呈正相关，与eGFR、SOD、T-AOC水平呈负相关；MMP-9表达与Cys-C、MDA水平呈正相关，与eGFR、SOD、T-AOC水平呈负相关；miR-142-3p表达与Cys-C、MDA水平呈正相关，与eGFR、SOD、T-AOC水平呈负相关，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达与肾功能、氧化应激指标的相关性 n=30

2.5 脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达相关性 脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9表达呈正相关(r=0.502，P=0.005)；脓毒症合并AKI患者MMP-9、miR-142-3p表达呈正相关(r=0.543，P=0.001)；脓毒症合并AKI患者Ang-2、miR-142-3p表达呈正相关(r=0.489，P=0.006)。见图1。

图1 脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达相关性图

3 讨论

脓毒症使机体内出现恶性炎性反应，炎性反应的产生主要是由于创伤、感染等反复多次的刺激，从而导致机体内产生了大量的炎性因子[9]。病情不稳定且多变，容易诱发合并AKI，随着患者病情进一步加重，或导致机体内多处器官出现衰竭，对患者生命健康安全造成严重威胁[10]。据相关研究指出，脓毒症一旦产生合并AKI，其致死率较高[11]。因此，众多国内外相关专家及学者探究脓毒症合并AKI发病机制，以期寻找新的脓毒症合并AKI治疗靶点。

Ang-2属于促血管生素中的一种，自身隶属于前炎性细胞因子，和细胞出现不同损伤的程度具有密切关系[12,13]。在相关研究中发现，Ang-2在脓毒症合并AKI中的表达量较高[14]。本结果显示，AKI组患者的Ang-2表达水平高于对照组和非AKI组，说明Ang-2的表达在脓毒症合并AKI发生发展的过程中出现明显升高，起到促进患者氧化应激反应的作用。不同临床特征脓毒症合并AKI患者Ang-2表达在重度、Scr水平≥110 μmol/L患者中表达较高，说明Ang-2在脓毒症合并AKI中呈现出较为异常的表达，并且其表达变化与脓毒症合并AKI患者病情严重程度密切相关。

MMP-9又名明胶酶B，属于MMPs家族中的重要组成成员，是一组能够对细胞外基质进行选择性降解的内肽酶，能够对明胶、胶原蛋白、弹性蛋白等外基质成分进行水解[15,16]。当MMP-9表达水平出现不平衡时，则会导致疾病的发生。据相关研究指出，MMP-9在脓毒症合并AKI中表达水平忽增，说明MMP-9参与脓毒症合并AKI发生发展的演进过程[17]。本结果显示，AKI组患者的MMP-9表达水平要高于对照组和非AKI组，通过进一步研究，不同临床特征脓毒症合并AKI患者MMP-9表达水平不同，在脓毒症患者病情严重的情况下，其MMP-9表达水平生升高，并且MMP-9表达变化与脓毒症合并AKI患者病情严重程度密切相关。

微小RNA(miRNA)以非编码单链形式在多数生物体之中大量存在，是一种长度21-25nt的非编码RNA和靶基因3’-非编码区(untranslated regions，UTR)结合后，会引起靶基因miRNA降解或抑制，影响生物免疫功能的发挥。与机体炎性反应、免疫系统调节等密切相关[18,19]。miR-142-3p作为miRNA家族中最具促炎活性的成员，在机体脏器组织中不仅能够将促炎作用发挥到极致，还能够参与多种炎症疾病的发生发展，成为评价机体炎性反应的重要标志物[20]。在相关研究中发现，miR-142-3p在脓毒症合并AKI中出现表达异常，其表达量较高[21]。本文研究结果显示，AKI组患者miR-142-3p表达量要高于对照组和非AKI组，预期研究结果一致。由此说明，miR-142-3p的表达在脓毒症合并AKI发生发展的过程中出现明显升高，进一步对不同临床特征脓毒症合并AKI患者miR-142-3p表达对比得知，重度、Scr水平≥110 μmol/L等患者的miR-142-3p表达较高，说明miR-142-3p在脓毒症合并AKI中呈现出较为异常的表达，并且其表达变化与脓毒症合并AKI患者病情严重程度密切相关，可能在后续脓毒症合并AKI诊断、治疗效果评估中成为新靶点。

本研究还对脓毒症合并AKI患者Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达与肾功能功能、氧化应激反应指标相关性及三者之间相关性进行研究。结果显示，Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达变化与脓毒症合并AKI患者肾功能、氧化应激反应指标均具有一定相关性，并且Ang-2、MMP-9、miR-142-3p在脓毒症合并AKI中具有相关性，由此本研究推测Ang-2、MMP-9、miR-142-3p可能共同参与脓毒症合并AKI的发生发展。

综上所述，Ang-2、MMP-9、miR-142-3p在脓毒症合并AKI患者中表达较高，三者的表达变化程度与脓毒症合并AKI患者的病理特征、肾功能、氧化应激指标具有一定相关性，且Ang-2、MMP-9、miR-142-3p之间也具有一定相关性，可能共同参与脓毒症合并AKI的发生发展。本研究也存在不足之处，病例数选取较少，并且未对Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达变化与脓毒症合并AKI患者的预后相关性进行相关研究，下一步研究需对样本量进行增加，探究Ang-2、MMP-9、miR-142-3p表达变化与脓毒症合并AKI患者预后的相关性。