凝血因子Ⅻ—抗血栓形成的新靶点

杨鑫萍，连琪，余伯阳，刘吉华，刘秀峰

(中国药科大学江苏省中药评价与转化重点实验室，中国药科大学中药可追溯与标准化研究中心，江苏 南京 210009)

血栓性疾病一直都是人类健康的一大杀手。全球每年有超过2 600万人死于各类血栓性疾病，且发病率逐年上升[1-2]。因此血栓性疾病的防治是当前公共卫生及医疗领域所面临的重要课题。目前可用于预防或治疗血栓性疾病的药物都存在不同程度的副作用，同时在使用这些药物的过程中往往会增加出血的风险，更甚者危及生命。因此在治疗血栓方面，迫切需要开发新的靶点及药物。近年来研究发现，抑制凝血因子Ⅻ(FⅫ)有相当大的可能在预防或治疗血栓的同时，不阻碍自身凝血[3]，是一个非常有前景的防治血栓药物开发靶点。

1 FⅫ作为抗血栓药物靶点的背景

血液凝固对于止血至关重要，但过度凝固又会导致血栓形成。目前用于防治血栓性疾病的药物，如肝素、维生素K拮抗剂(华法林)、凝血酶抑制剂和Xa因子抑制剂，大都针对凝血级联反应中的关键酶，这些酶对纤维蛋白的形成缺一不可，纤维蛋白的形成是生理止血必不可少的环节[4]。因此，靶向这些关键酶的抗凝剂都会增加出血的风险，甚至危及生命[5]。近年来有研究表明FⅫ在体外可以促进凝血，而FⅫ基因缺乏的动物都具有完全正常的止血功能。

Kleinschnitz等[6]通过短暂闭塞小鼠脑动脉后，发现FⅫ基因缺乏组和FⅫ抑制剂治疗组的脑梗死体积明显小于野生型对照组，并且未出现梗死相关的出血。FⅫ功能缺失使缺血血管中纤维蛋白的形成减少，加入重组人的FⅫ蛋白后，纤维蛋白形成功能得以恢复。Renné等[7]通过比较FⅫ基因敲除小鼠和野生型小鼠，分别使用 3种动脉血栓模型探讨FⅫ 对血栓形成的影响：在FeCl3诱导的肠系膜动脉血栓模型中，野生型鼠肠系膜动脉几乎全部发生血栓闭塞，而FⅫ 基因缺乏小鼠中仅半数出现栓塞，即使出现血液凝固现象也仅是短暂的不稳定的孤立性栓塞；在机械性损伤腹主动脉、结扎损伤颈总动脉模型中也出现类似现象，FⅫ 基因缺乏小鼠基本无闭塞性血栓形成，并且活化部分凝血活酶时间 (APTT)明显延长，但在小鼠断尾实验中的出血检测或外科手术过程中未出现异常自发性出血或长时间损伤相关出血。此外，使用人的FⅫ蛋白治疗的FⅫ基因缺乏小鼠APTT回归正常，并恢复了血栓形成的能力。Revenko等[8-9]也证明了FⅫ基因缺乏或功能缺陷可以减少动脉和静脉血栓形成模型中的血栓形成，且对自身凝血功能未造成不良影响。抑制FⅫ功能可以减少血管中纤维蛋白的形成，说明FⅫ有助于通过内在途径进行病理性凝血。这些数据表明，病理性血栓形成中涉及的一些过程与正常止血不同。由于 FⅫ 似乎对病理性纤维蛋白的形成有促进作用，且对于自身凝血功能是可有可无的，因此以FⅫ 作为抗血栓药物新靶点可能为安全防治血栓栓塞性疾病提供选择。

2 FⅫ的生理作用及其在血栓形成中的作用

FⅫ参与体内血液凝固、炎症和免疫等多种生理过程(见图1)。生理情况下血液凝固是由两种不同的途径相互合作形成的。这两种途径分别由组织因子(TF)和FⅫ触发，后一种途径被称为“内源性凝血途径”。FⅫ与聚阴离子表面(如玻璃，聚磷酸盐或鞣花酸)接触而被激活形成FⅫa(称为接触活化)，FⅫa是丝氨酸蛋白酶家族中的一员。然后，活化的FⅫa启动两种生理功能，一是内在凝血：通过激活FⅫa底物因子Ⅺ(FⅪ)形成有活性的FⅪa(也是一种丝氨酸蛋白酶)；二是激肽释放酶-激肽酶系统，产生促炎介质缓激肽，导致血管扩张，从而降低血压。当血管或组织破损时，TF暴露从而与FⅦa结合，外源性凝血途径启动，继而通过激活FⅩ进入凝血级联反应的共同途径，从而生成最初的凝血酶。但是生成的TF-FⅦa复合物数目有限，并且生成的凝血酶很快会被组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)所抑制，所以最终只产生微量凝血酶。这些微量的凝血酶可以进一步活化血小板、FⅧ及对FⅪ的正反馈作用而产生放大效应，继而内源性途径参与形成足够达到止血需要的凝血酶。因此，生理止血是由TF激活的外源性凝血途径启动，而内在凝血途径主要参与凝血的放大和扩布，对凝血反应开始后的维持和巩固起非常重要的作用。病理情况下，还同时存在接触激活的内在凝血途径，主要途径是活化的FⅫa激活FⅪ，通过全程的(以FⅫ为起点)内在凝血途径的瀑布反应，生成超大量的凝血酶，促使血栓形成。临床观察也发现，先天性缺乏FⅫ和前激肽释放酶或高分子量激肽原的患者，几乎没有出血症状，表明这些因子参与的表面激活过程在体内生理性止血中不起主要作用，却可以促进病理血栓的形成。由此表明，血栓形成与生理止血过程存在接触激活相的不同。

图1 FⅫ 的生理功能机制图

接触活化系统是由FⅫ激活引发的蛋白酶级联反应。该系统分别通过凝血的内在途径和激肽释放酶-激肽系统启动促凝反应和促炎反应。体外的生化原理已经有大量的研究，而体内的接触活化系统的激动剂及其对疾病的影响仍存在疑问。最近的实验和临床数据确定了错误折叠的蛋白质，胶原蛋白和多磷酸盐是体内接触系统的激活剂[10]。经接触系统活化的FⅫ启动了凝血的内在途径，而FⅫ缺乏的个体却未出现病理性出血，这表明FⅫ在受伤的血管壁未被激活，或FⅫa对纤维蛋白的形成没有显著的作用。

3 FⅫ作为抗血栓药物靶点的重要依据

3.1 理论依据 FⅫ不仅是内源性凝血途径的起点，更是接触活化系统的中心[11]。在内源性途径中，FⅫ通过接触活化成FⅫa，FⅫa进一步激活FⅪ，从而激活FⅨ，快速引起凝血级联反应，产生大量凝血酶。FⅫa驱动的纤维蛋白形成对于病理性血栓形成和稳固至关重要，而对于生理性损伤部位止血期间的纤维蛋白形成没有突出的贡献。然而，凝血级联反应中其他因子的缺乏，如因子Ⅷ和Ⅸ，将会导致严重的出血风险(分别为血友病A和B)。FⅫ在介导病理性血栓形成方面的这种可选择性，为抑制FⅫa活性从而预防病理性血栓形成提供了安全策略[12]。

3.2 动物实验依据 Pauer等[13]使用基因靶向技术通过两种不同的遗传手段生成了FⅫ基因缺陷的小鼠，相比之下，凝血因子ⅪⅧ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅴ、Ⅱ和纤维蛋白原的表达在FⅫ基因缺乏组和野生型组之间没有差异。根据孟德尔遗传规律的内容来看，FⅫ基因缺乏不会增加胎儿死亡率。此外，FⅫ基因缺乏的雄性和FⅫ基因缺乏的雌性交配后的产仔量是正常的，表明FⅫ基因缺陷不会影响妊娠。并且，FⅫ基因缺陷小鼠的解剖结构与两种遗传背景上的野生型幼崽的解剖结构难以区分，说明FⅫ的缺乏不会引起体内纤维蛋白溶解受损，亦不会导致易栓症[14]。综上，缺乏FⅫ基因的小鼠不会影响小鼠的生长发育和繁殖。

Müller等[15]发现FⅫ和FⅪ双基因缺乏小鼠与仅缺乏其中一种基因的小鼠相似，均免受多磷酸盐导致的致命性肺栓塞，这表明FⅫa是通过激活FⅪ启动内源性凝血途径从而产生纤维蛋白的。与此相一致的是，特异性靶向FⅫa介导FⅪ激活的抗FⅪ单克隆抗体可有效干扰血浆中内在途径介导的纤维蛋白形成以及小鼠和狒狒血栓形成[16]。Müller等[17]发现FⅫ基因缺乏可使小鼠各种动脉和静脉血管中血栓形成减少，且避免了各种机械或化学损伤导致的血栓。FⅫ浓度仅有正常血浆一半的小鼠与野生型小鼠的血栓形成程度相似，表明50%的FⅫ便足以促使闭塞性凝块形成。目前使用的许多抗凝剂抗凝效果随着其血浆浓度的增加而提高的同时出血风险也随之增加，而FⅫ抑制剂在高血药浓度的情况下，不仅保持良好的抗凝效果也不存在出血风险。由此可见，抑制FⅫ/FⅫa对不同动物模型动静脉血栓形成均有抑制作用，且优于传统抗血栓药物。

4 以FⅫ为抗血栓靶点的药物开发与研究进展

在过去的三十年中，已经开发了各种类型抗FⅫ/FⅫa的药物。目前为止，FⅫ/FⅫa的抑制剂领域仍由大分子主导，小分子较为稀缺。现总结了三十年以来专利及非专利文献报道的靶向FⅫ/FⅫa的抑制剂并进行汇总(见表1)。主要概括了抑制剂类型、开发阶段及适应证。

表1 现有靶向FⅫ/FⅫa的药物开发情况

表1(续)

表1概括了近三十年来靶向FⅫ/FⅫa的抑制剂，主要包括小分子配体、肽类、蛋白质、反义寡核苷酸、siRNA和单克隆抗体。其中一些是直接作用于FⅫa活性位点的抑制剂，而另一些则是靶向FⅫ酶原或破坏其生物合成。虽然许多FⅫ抑制剂尚处于早期研究阶段，但已有几种在血栓形成、败血症、HAE、阿尔茨海默病(AD)、多发性硬化(MS)的动物模型中显示出其功效，甚至进展到人体临床试验中。这些抑制剂的临床应用价值，有待进一步研究，或许可为设计新的高效、特异性FⅫ/FⅫa抑制剂提供参考。

5 总结

综上所述，FⅫ参与血栓形成和炎症发生，是一个新的有开发前景的药物靶点。在过去三十年中，靶向 FⅫ/FⅫa的抑制剂在小分子和大分子开发均取得成效，处于不同的发展阶段。已开发的这些药物的临床研究使人们有理由相信其中一些将成为获批准的药物。我国是一个天然药物资源库，为从天然产物中寻找以FⅫ为靶点的抗血栓药物提供了资源保障。目前国内外多个课题组正在进行与FⅫ在健康和疾病中的相关研究，这些研究结果将进一步促进新的FⅫ抑制剂的开发，将对血栓性疾病的防治发挥重要的作用。