鱼腥草多糖的理化性质及抗氧化活性研究

罗秋莲

(广西大学化学化工学院,广西南宁 530004)

鱼腥草(Houttuyniacordata) 又名折耳根、蕺菜、紫蕺等, 为三白草科蕺菜属多年生草本植物,是我国传统的药食两用的食材之一,因其特殊的腥味而得名。鱼腥草具有利尿通淋、清热解毒、消肿排脓等功效,用于治疗肺痈吐脓、痰热喘咳、热痢、热淋、痛疮肿毒等症,其主要成分为挥发油、多糖类、黄酮类、生物碱、维生素等[1-2]。研究表明,鱼腥草多糖具有抗病毒作用；鱼腥草水提物对血热病毒(EHFV)有一定抑制作用；鱼腥草是很好的免疫调节剂，它能增强白细胞的吞噬功能[3-4]。目前国内外对鱼腥草的研究主要集中在挥发油成分上,而对鱼腥草多糖的结构和生物活性研究还鲜有报道。该试验以热水浸提取得的鱼腥草多糖为研究对象,通过测定鱼腥草多糖对羟基自由基、DPPH自由基的清除和亚铁离子的螯合能力,评价鱼腥草多糖的抗氧化活性,运用紫外光谱仪和傅里叶红外光谱仪对其基本理化性质进行分析,以期为鱼腥草多糖的结构信息和生物活性研究奠定基础,有利于鱼腥草资源的开发应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1研究对象。新鲜鱼腥草,洗净晾干,粉碎后备用。

1.1.2主要试剂。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma-Aldrich公司；抗坏血酸(VC)、浓硫酸、三氯乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、菲诺嗪、四水合氯化亚铁、铁氰化钾、七水合三氯化铁、邻二氮菲、无水乙醇、硫酸亚铁、30%双氧水，均为国产分析纯；试验用水为超纯水。

1.1.3主要仪器与设备。LYNX6000高速离心机,Thermo Scientific公司；AE-200电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；UV-1800 紫外光谱仪,日本岛津公司；Mili-Q Advantage A10超纯水系统,美国Millipore公司；Nicolet iS50 FT-IR红外光谱仪，美国Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1多糖的提取工艺流程。鱼腥草洗净、晾干→粉碎机粉碎→95%乙醇浸泡24 h→离心、抽滤→滤渣低温烘干→90 ℃热水浸提滤渣3次(每次2 h)→离心、抽滤→合并滤液→蒸发浓缩→85%乙醇沉淀24 h→离心分离→冷冻干燥→脱蛋白→鱼腥草多糖。

1.2.2多糖含量的测定。采用苯酚-硫酸法[5]测定多糖含量。

1.2.2.1葡萄糖标准溶液的制备。精确称取200 mg干燥至恒重的葡萄糖,以超纯水定容至50 mL容量瓶中，取1 mL该溶液于50 mL容量瓶中定容,得浓度为0.08 mg/mL葡萄糖标准溶液。

1.2.2.2鱼腥草多糖溶液的制备。精确称取鱼腥草多糖40.0 mg,定容至100 mL容量瓶中，取1 mL该溶液于10 mL容量瓶中定容,得到0.04 mg/mL鱼腥草多糖溶液。

1.2.2.3标准曲线的绘制。分别吸取葡萄糖标准溶液(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL)于干燥试管中,以超纯水各补至2.0 mL,再依次加入6%苯酚溶液1.0 mL和5.0 mL浓硫酸,摇匀,室温下放置20 min后于490 nm处测定其吸光度。以超纯水作为空白,以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2.4多糖含量的测定。配制适当浓度的多糖样液,吸取多糖溶液1.0 mL,按“1.2.2.3”操作步骤进行,测定样品溶液吸光度,多糖含量按以下公式计算：

(1)

式中,0.91为多糖的校正系数。

1.2.3多糖的脱蛋白。准确称取鱼腥草多糖4.0 g,以超纯水溶解后加入Sevage试剂(V氯仿∶V正丁醇=4∶1),多糖溶液和Sevage试剂按3∶1的体积混匀后剧烈振摇30 min。放室温下静置2 h后,以转速为8 000 r/min离心5 min,分出水层和有机层之间的沉淀。分液后,水液溶解重复以上步骤,直至沉淀完全析出。

1.2.4紫外光谱分析。取适量多糖样品以超纯水溶解后,于190～400 nm进行紫外光谱扫描。

1.2.5红外光谱分析。取多糖样品约1 mg,以KBr压片,使用Nicolet iS50 FT-IR傅里叶红外光谱仪于4 000～500 cm-1进行扫描。

1.2.6抗氧化活性研究。以对羟基自由基、DPPH自由基的清除和亚铁离子螯合能力为指标[5],研究鱼腥草多糖的抗氧化活性。

1.2.6.1羟基自由基清除能力测定。在Chen等[6]方法的基础上作微小改动对鱼腥草多糖的羟基自由基清除能力进行测定。往6支试管中依次加入1.5 mL邻二氮菲(0.5 mmol)、2 mL磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L,pH=7.4)、1 mL 硫酸亚铁溶液(0.75 mmol),混匀。往样品组中加入1 mL多糖溶液(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和6.00 mg/mL)、1 mL 过氧化氢(0.01%,v/v),混匀后,置37 °C下恒温反应1 h,测定536 nm处的吸光度。以抗坏血酸(VC)作为阳性对照,以超纯水作为空白,平行测定3次,取平均值。按以下公式计算鱼腥草多糖对羟基自由基的清除能力：

(2)

式中,As为样品组吸光度,A1为对照组吸光度,A0为空白组吸光度。

1.2.6.2DPPH自由基清除能力测定。在Jahanbin等[7]方法的基础上作微小改动对鱼腥草多糖的DPPH自由基清除能力进行测定。往6支试管中加入2 mL不同浓度的多糖溶液(0.05、0.10、0.20、0.40、0.60和0.80 mg/mL)和2 mL DPPH-乙醇溶液(0.1 mmol),室温下暗处避光反应30 min,测定517 nm处的吸光度。用抗坏血酸(VC)作为阳性对照,以超纯水作为空白,平行测定3次,取平均值。按以下公式计算鱼腥草多糖对DPPH自由基的清除率：

清除率=(1-As/A0)×100%

(3)

式中,A0为空白组吸光度,As为样品组吸光度。

1.2.6.3亚铁离子螯合能力。在Hu等[8]方法的基础上作微小改动对鱼腥草多糖的亚铁离子螯合能力进行测定。分别往试管中加入1 mL 不同浓度多糖溶液( 1、2、3、4、5和6 mg/mL)、 0.2 mL菲啰嗪溶液(5 mmol)、0.1 mL 氯化亚铁溶液(2 mmol)和3.7 mL超纯水,混匀。室温下反应10 min后,测定562 nm处的吸光度,用乙二胺四乙酸(EDTA)作为阳性对照,以超纯水作为空白，平行测定3次,取平均值。按以下公式计算鱼腥草多糖的亚铁离子螯合能力：

亚铁离子螯合能力=(1-As/A0)×100%

(4)

式中,A0为空白组吸光度,As为样品组吸光度。

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定以葡萄糖浓度为横坐标(X)、吸光度为纵坐标(y)绘制标准曲线，得出标准曲线回归方程为y=12.994x+0.06(R2=0.996 6)。结果显示在葡萄糖浓度为0～0.08 mg/mL 线性关系良好。根据标准曲线回归方程，计算得出鱼腥草多糖含量为62.33%。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 紫外光谱分析经典的Sevage法脱蛋白效果较明显,但其不足之处在于多糖的损耗率较大,因此参考文献[5]选择脱蛋白次数为4次。如图2所示,紫外光谱图显示多糖在200 nm波长附近处有多糖较弱吸收峰,说明该物质含有多糖成分。在260和280 nm波长处无明显的吸收峰,说明多糖样品中不含蛋白质和核酸成分,或所含蛋白质和核酸的量很低,Sevage法将此类物质已基本除净。

图2 鱼腥草多糖的紫外光谱图

2.3 红外光谱分析鱼腥草多糖的红外光谱扫描如图3所示,由图3可知,多糖在4 000～500 cm-1有多处吸收峰,在3 404.27 cm-1波长处有羟基的强烈伸缩振动吸收峰,2 927.05 cm-1处有甲基的C—H较弱伸缩振动吸收峰,这都是多糖的特征吸收峰[9-10]。1 775～1 725 cm-1没有吸收峰,说明该物质没有羧酸或者乙酰氧基上的C==O伸缩振动吸收峰,表明该多糖为中性多糖；1 620.28 cm-1处的吸收峰为结晶水或者水化物的吸收峰[9,11]；1 386.48 cm-1处的吸收峰为C—H的变角振动吸收峰；1 101.42、1 046.98和1 014.95 cm-1是吡喃糖环的特征吸收峰,来自吡喃糖环的C—O—H伸缩振动和C—O—C糖苷键的非对称振动吸收峰[9-10]。在835.59 cm-1处有弱吸收峰，表示多糖中可能含有 α-D-半乳吡喃糖、α-D-葡萄吡喃糖、β-D-阿拉伯吡喃糖或者α-D-甘露吡喃糖；在761.92 cm-1有明显吸收峰，表明有 α-D-木吡喃糖[9,11]。根据红外光谱分析结果可以鉴定鱼腥草多糖是含有α-或β-构型的吡喃中性多糖。

图3 鱼腥草多糖的红外光谱图

2.4 抗氧化活性研究

2.4.1羟基自由基清除能力。羟基自由基被认为是最具有活性、对人体毒害最强、毒性最大的一种自由基,它可以穿过细胞膜作用于碳水化合物、蛋白质、脂质等生物分子引起氧化损伤导致细胞死亡从而引发衰老等各种疾病[12]。因此,在生命体内对羟基自由基的清除具有重要意义。从图4可以看出，鱼腥草多糖对羟基自由基具有较好的清除效应,且多糖浓度与清除率呈现明显的量效关系,清除率随着浓度的增大而上升。当浓度为0.25 mg/mL时,对羟基自由基的清除率较低，为6.3%；当多糖浓度达到6.00 mg/mL时,对羟基自由基的清除率上升至69.35%;,但与VC阳性对照组相比,其抗氧化活性相对较弱。

图4 鱼腥草多糖对羟基自由基的清除

2.4.2DPPH自由基清除能力。DPPH是一种自由基复合物,被广泛用于证实各种样品的自由基清除能力。DPPH自由基在醇溶液中稳定存在时呈现紫色,遇到抗氧化物时可使DPPH自由基孤对电子被配对而导致溶液变成淡黄色[13-14]。从图5可以看出,在0.05～0.80 mg/mL时,鱼腥草多糖对DPPH自由基具有明显的清除效应,并且清除能力与多糖浓度成正比。当多糖浓度达到0.80 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率上升至83.36%,与VC阳性对照组的清除率基本相当,表明鱼腥草多糖对DPPH自由基的清除能力很强。

图5 鱼腥草多糖对DPPH自由基的清除

2.4.3亚铁离子螯合能力。在不同种类的金属离子中,Fe2+被认为是最强的氧化剂,这是由于它的反应活性高,可以加速脂质氧化分解氢自由基以及脂质过氧化物酶活性，它的主要作用机理为Fe2++H2O2→Fe3++ OH· + OH-[15]。从图6可以看出，鱼腥草多糖对亚铁离子具有一定的螯合能力,在1～6 mg/mL时,多糖对亚铁离子螯合能力随着浓度的增大而增强,当浓度为1 mg/mL时，对亚铁离子的螯合能力为6.9%,具有较弱的螯合能力；当浓度为6 mg/mL时，对亚铁离子的螯合能力上升为30.54%,螯合能力明显增强；但与阳性对照组相比,其螯合能力远弱于EDTA。

图6 鱼腥草多糖对亚铁离子的螯合能力

3 结论

该试验以热水浸提并经脱蛋白后得到的鱼腥草多糖作为研究对象,对其基本理化性质和体外抗氧化活性进行研究。紫外光谱图显示多糖在200 nm波长附近处有多糖较弱吸收峰,表明该物质含有多糖成分。红外光谱仪检测结果表明,鱼腥草多糖具有多糖的特征性基团,是含有α-或β-构型的吡喃中性多糖。抗氧化活性试验结果表明,鱼腥草多糖对DPPH自由基具有很强的清除能力,在高浓度时,其清除能力与阳性对照组基本相当,对羟基自由基的清除和亚铁离子的螯合能力均表现出较好的抗氧化效应,且随着多糖浓度的增大,其清除效应越强,呈现出明显的量效关系。该研究可为后续深入探究鱼腥草多糖的高级结构信息和生物活性研究奠定基础,有利于鱼腥草资源的开发与利用。