基于血液中阿尔茨海默症蛋白标志物的研究进展

苏莹莹，王 准，孙英旗，张雨佳，宋相伟

随着全球人口老龄化现象愈加严重，老年疾病问题成为一大难题.最具有代表性的老年疾病阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）主要分为主观认知下降（Subjective cognitive decline，SCD）、轻度认知障碍（Mild cognitive impairment，MCI）和痴呆几个阶段（Dementia of the Alzheimer type，DAT）［1］.AD 已经逐渐成为了老年人的头号慢性杀手.AD 的发病机制学说中最为热议的有以下2 种：β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）沉积及毒性作用和Tau 蛋白过度磷酸化（P-tau）或总Tau 蛋白（T-tau）神经原纤维缠结［2］.目前对于AD 的研究还在不断地深入，但是还没有找到有效的治疗手段，因此更多的研究把重点转移到早期诊断、预防，以及干预治疗上.

早期AD 最常用的检测方法有影像学诊断方法，如正电子发射型计算机断层显像技术（Positron emission computed tomography，PET）、磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、脑脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）检测等，但影像学方法只能在AD 的中晚期才能检测到，不能起到预防的作用，且费用昂贵，因此成像技术由于不能广泛使用而逐渐被取代［3］.而CSF主要是针对AD 相关生物标志物的检测如Aβ蛋白、Tau 蛋白、β 分泌酶、载脂蛋白，以及核酸水平非编码RNA 等，此诊断技术是AD 早期诊断的重点之一，但CSF 中检测的样本需要腰椎穿刺，这种侵入性检测方式可能会引起一定概率的并发症，对患者也存在一定的风险［4］.相比之下，液体活检—血液生物标志物检测作为一种分子诊断技术，血液样本的提取方便快捷、风险最小、成本也较低，一次只需少量血液即可检测［5］.

本文主要给出几种血液中的AD 蛋白生物标志物，包括Aβ 淀粉样蛋白、Tau 蛋白、载脂蛋白E、神经丝轻链蛋白和外泌体等方面的研究进展，概述了血液检测相对于PET 和CSF的优势所在，并与AD 的病理学特征相联系，讨论了将面临的挑战，以及未来展望.

1 β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）

1.1 Aβ1-42、Aβ1-40、Aβ1-42/Aβ1-40

AD 的主要病理学特征是β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成老年斑，β 淀粉样蛋白前体蛋白（APP）被β 分泌酶和γ 分泌酶水解产生Aβ，主要以Aβ1-40 和Aβ1-42 两种形式存在［6］，但Aβ1-40 神经毒性远远小于Aβ1-42，且在AD 过程中几乎无明显变化，Aβ1-42 可在脑内聚集形成老年斑，损伤神经元等神经细胞［7］，因此以Aβ1-42/Aβ1-40 比值更能表现Aβ 总量在AD 过程中的变化趋势.

研究显示，AD患者血浆内的Aβ1-42/Aβ1-40有明显的下降趋势，且与脑脊液中的检测结果有较高的相关性［8］.一项免疫沉淀结合质谱（Immunoprecipitation mass spectrometry，IP-MS）的研究结果发现，血浆中Aβ1-42 及Aβ1-40水平呈下降趋势，此方法可以将高水平Aβ（Aβ+）和低水平Aβ（Aβ-）区分开来，且敏感性和特异性超过90%［9］.而采用单分子免疫列阵（Single-molecule array，Simoa）检测发现血浆中Aβ 水平与脑脊液中Aβ 水平呈正相关，与对照组相比，AD 患者Aβ1-42 以及Aβ1-40 的含量均有下降趋势，且Aβ1-42/Aβ1-40 在MCI患者血浆内有下降趋势，AD 患者血浆内下降趋势更明显［10］.

以上研究结果皆表明Aβ 在MCI 患者血液内呈上升趋势，而一旦进入痴呆晚期则会下降［8-10］，因此血液中Aβ 变化情况可作为诊断AD 的重要预测因子，并且在临床应用上可能优先于脑脊液或PET 检测方法的使用.但目前有些研究结果还存在着矛盾，血浆中检测到的Aβ 来源于外周组织，不能完全反映脑内Aβ 的变化，也可能与Aβ 的疏水性密切相关，使其与血浆蛋白结合，导致测量结果不准确［11］.因其在血液中的变化有着重要的意义，结合其他检测方法能更好地完成AD 的早期预测与诊断.

1.2 Aβ 二级结构

AD 患者的β-淀粉样蛋白（Aβ）肽的二级结构会从正常的无序状态或α-螺旋改变为“病理性的”富含β-折叠（β-sheet）的二级结构.这种富含β-sheet 的结构聚集在一起，可以形成可溶性的有毒低聚物，最后形成肉眼可见的淀粉样斑块，这在临床上通常被认为是导致AD 神经变性的原因，所以在临床早期诊断出Aβ 二级结构的改变对检测阿尔茨海默症至关重要［12］.

NABERS 等人使用免疫红外传感器检测发现，AD 患者血液中Aβ 的含量显著下降，Aβ 错误折叠成了β-sheet 富集构象，且研究结果与CFS、PET 结果密切相关，血浆检测Aβ二级结构的特异性和敏感性与脑脊液中Aβ二级结构的检测结果十分接近，这表明Aβ 二级结构的改变可以作为AD 的血液生物标志物［12-13］，但由于Aβ 的结构不稳定，可能在数小时内发生变化，该技术需要相对较高的技术，必须得到其他独立研究的证实.

Aβ 在MCI 时期会有上升趋势，随着痴呆症状的严重，Aβ 就会过多地错误折叠成βsheet 富集构象，这也是造成AD 的主要原因之一（图1），但对于Aβ 的错误折叠仍可能存在于非AD 患者中，而在一些AD 患者中不存在，因此会出现假阴性和假阳性的情况［14］，这也说明需要更多独立临床的研究去验证其准确性与敏感性，使Aβ 二级结构的改变成为检测AD 一个独立的标志物.

图1 Aβ 二级结构的形成

2 Tau 蛋白

Tau 是一种正常的、未展开的、高可溶性的蛋白，在AD 中，Tau 蛋白翻译后修饰，特别是过度磷酸化被认为是影响微管组装和诱导Tau 蛋白聚集的关键因素［15］.在Tau 蛋白过度磷酸化过程中，Tau 蛋白发生构象变化，Tau 蛋白单体转化为Tau 低聚物诱导Tau 蛋白聚集成成对螺旋状，导致脑细胞神经纤维缠结（NFTs）的形成（图2）.科学证据表明，Tau 蛋白低聚物是导致AD 突触损伤的毒性最大的蛋白形式［16］.

图2 NFTs 的形成

Tau 磷酸位点与AD 密切相关，包括Ptau181、P-tau217 和P-tau231，其中P-tau181 在AD 的研究中最广泛，准确度也最高.一项研究采用Simoa 和电化学发光MSD（Meso Scale Discovery，MSD）的方法对临床患者，以及对照组血浆中的总Tau（T-tau）和P-tau181 水平进行检测，结果显示AD 患者血浆中T-tau 和Ptau181水平明显高于健康人群［17］.BARTHELEMY等人采用质谱（MS）的分析方法发现，血浆中P-tau217 和P-tau181 与CSF 呈高度的正相关，脑脊液与血浆T-tau 蛋白水平和测量值之间无相关性，P-tau217 和P-tau181 对淀粉样斑块病理具有高度特异性［18］.此外还有学者采用Simoa 在四个临床试验中做出关于P-tau181 蛋白的评估，研究发现在验证的所有个体中，认知未受损的老年人和年轻人P-tau181 蛋白水平明显低于AD 组以及淀粉样-β 阳性的MCI组，因此可通过血浆中P-tau181 水平来区分AD 和健康人群［19］.

Tau 蛋白神经纤维缠结，以及磷酸化作为AD 的病理学研究的核心蛋白，其在血液中的检测可作为区分认知未受损的正常人群和AD 患者的重要指标.尽管目前研究表明Tau蛋白在AD 中发挥着重要作用，但其特异性还有待研究，在许多其他老年疾病如中风、创伤性脑组织损伤等Tau 蛋白也会有上升的趋势［17］，与之相比脑脊液中的Tau 蛋白的检测结果特异性和准确性会更高些，因此在未来血液中对Tau 蛋白的检测仍需发掘新技术和更多的数据去验证其准确性.

3 载脂蛋白E（ApolipoproteinE，ApoE）

载脂蛋白E（ApoE）是一种广泛表达于人体的35-kDa 糖蛋白，具有多态性和遗传上的异质性，作为脂质转运体ApoE 基因在群体中存在三个不同的蛋白亚型：ApoE2、ApoE3 和ApoE4，以及三种编码基因：ɛ2、ɛ3 和ɛ4，其中导致患AD 的主要是ɛ4 等位基因，ɛ3 是最常见的基因型但无致病性，ɛ2 则有预防AD 发病的作用.大量研究表明ApoE4 亚型与AD 的主要病理特征，如Aβ 蛋白沉积、Tau 蛋白过度磷酸化及神经纤维缠结，以及该疾病的其他标志（包括炎症和氧化应激）息息相关［20-21］.

TENG 等人采用多重免疫分析（MyriadRBM）的方法研究了参与者的血浆ApoE 水平和海马体积磁共振成像指数之间的横断面关联.在认知正常组（NC 组）和MCI 组中，血浆中ApoE较低的个体海马体积或海马径向距离也相对较小，且这些关联都是在一个携带ApoEε-4 等位基因的携带者发现的，血浆ApoE 水平可能代表了非AD个体转化为AD患者的外周标志［22］.另有研究采用蛋白免疫印迹（Western blot），以及免疫染色的方式检测了受试者血浆中ApoE 的浓度，结果显示晚期AD 患者血浆中ApoE 浓度明显高于对照组，研究表明AD 患者血浆ApoE 水平的升高与Aβ 淀粉样蛋白的增长趋势呈正相关，为了阐明ApoE 亚型与Aβ 相互作用的性质和意义，并确定ApoE 的水平是否在AD 的发病机制中起着关键作用，还需要进一步的研究［23］.

ApoE 与AD 之间有着密不可分的关系，ApoE 蛋白的多态性会引起细胞毒性导致Aβ沉积从而完成MCI 到AD 的转化，除以上研究以外，更有研究证明在脑脊液中ApoE4 与Tau蛋白之间也有着千丝万缕的联系［24］，这也说明ApoE4 可以通过多途径增加患AD 的概率.而ApoE 作为血液中一种常见的蛋白，其特异性还有待研究，如果能有效地分离血浆中的ApoE，会大大地提高ApoE 作为诊断AD 的特异性和准确性.

4 神经丝轻链蛋白（neurofilaments，NfL）

神经丝轻链蛋白（NfL）是神经丝三联蛋白的一个亚单位，NfL 的异常表达及人类的NfL 基因突变与多种疾病密切相关［25］.正常情况下，轴突会释放少量的NfL，随着年龄的增加，NfL 的释放会逐渐增多，一些炎症性和神经退行性疾病会导致中枢神经系统的轴突急速释放大量的NfL［26］.

在一项横断面研究中，对受试者采集血清用ELISA 检测NfL 水平，AD 患者和MCI 患者的NfL 水平明显高于对照组，且MCI 组的结果最高，这些结果提示血清NfL 蛋白也许可以作为预测AD 早期的外周血生物标志物，为前期的诊断及早期治疗提供依据［27］.MATTSSON等人采用Simoa 技术检测结果发现血浆中NfL与脑脊液中NfL 检测结果呈正相关，MCI 患者与AD 患者的血浆NfL 相比对照组升高，由此证明高血浆NfL 与认知不良和AD 相关萎缩（在基线和纵向上）及脑低代谢（纵向）相关［28］.

随着有关血浆中NfL 的研究逐渐深入，可发现血浆中NfL 浓度似乎反映了神经元的损伤程度，且与AD 相关蛋白Aβ、Tau 蛋白等息息相关.另有研究表明血液中NfL 的浓度与年龄也呈高度正相关，随着年龄的增长，血浆中NfL 也逐渐增加［29］，因此对于血浆中NfL 浓度与衰老机制的关系还不够明确，还需进一步研究，使血浆中NfL 的检测成为诊断早期AD的一个重要的生物标志物.

5 外泌体中的蛋白标志物

外泌体（Exosomes）是大脑中神经元细胞、小胶质细胞和星胶质细胞等分泌在细胞外的囊泡结构，其内携带功能性信使RNA、非编码RNA、蛋白质（Aβ、Tau 等）、脂类、DNA 等来源细胞的生物活性物质（图3），在大脑中，外泌体参与细胞通信来调节细胞功能［30］，而且通过CSF 在全脑广泛传播，因此，外泌体及其组分主要在AD、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病中发挥作用.目前对AD 外泌体的研究主要是通过检测AD 相关蛋白（Aβ、Tau、突触蛋白等）和miRNA［31］.

图3 血液中的外泌体

对血液外泌体样本中Aβ、Tau、P-tau181蛋白进行了ELISA 检测，发现早期AD 患者血液外泌体中的Aβ、Tau、P-tau181 水平明显升高［32］.另一项研究则采用Western blot 对血液外泌体进行了分析，结果显示AD 组外泌体中的Aβ、T-tau 和P-tau181 浓度均高于MCI 组和对照组，每个外泌体生物标志物的水平与脑脊液中的水平呈高度相关［33］.血液外泌体的检测可以预测到MCI 向AD 的转化，因此从血液检测外泌体中的特定毒性蛋白有望成为诊断早期AD 的一种方法［34］.

除此之外，血清外泌体ATP 结合盒转运体A1（ABCA1）蛋白，是一种在外泌体生成过程中被装载到外泌体膜上的蛋白，研究表明ABCA1 蛋白参与AD 的发展过程［35］.采用ELISA 和MS 的检测方法分别对小鼠和临床患者做了两组实验，研究结果发现高浓度ABCA1外泌体可通过血脑屏障到达外周血而被有效检测，随着AD 的进展程度，血清中外泌体ABCA1 蛋白会逐渐升高，但在主观认知下降（SCD）组上升得并不显著，因此对于血清中外泌体ABCA1 蛋白的检测或许可以成为诊断AD 的一个新的外泌体蛋白标志物［36］.

外泌体是由磷脂双分子层构成，因此可通过胞吞作用跨越血脑屏障.但由于血浆的高黏度，外泌体的分离纯化变得复杂，许多研究开始通过富集和纯化血液来检测和分析神经源性外泌体中的蛋白质［37］.如果能从血液中成功提纯神经源性外泌体，将会更快地实现AD 的血液外泌体检测和诊断.

6 结语

根据血液中蛋白标志物的变化趋势能够在AD 早期进行诊断，且与CSF 和PET 的检测方法相比较，血液检测更具有灵敏性、便捷性.但由于血液中AD 相关蛋白的含量较低，导致检测结果存在一定的差异性与局限性，还需大量的重复实验才可投入到临床应用.总而言之，关于AD 蛋白标志物的研究还需要回归到AD 病理机制的问题进行研究，且随着检测技术的不断发展，有关血液中新的蛋白标志物在不断地挖掘，其敏感性与特异性也会在研究中不断提高，未来液体活检技术将会成为最具潜力的一种检测方式.