PU-H71对结直肠癌HCT-15细胞凋亡和周期的影响

田朵朵，邓 程，赵学荣，王建平，郑华川，肖丽君*，赵恩宏

(1.承德医学院基础医学院，河北承德 067000；2.承德医学院附属医院）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球第三大常见癌症和第四大致命癌症，每年都有超过80多万人因其死亡[1]。随着癌症筛查的措施逐渐增多，如今结直肠癌的诊出率和死亡率都有所降低，但结直肠癌的分子机制不是十分明确，所以探求高效的分子靶点仍是关键。热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）是一种进化比较保守的伴侣蛋白，可以参与200多种蛋白质的折叠装配过程，在体内参与细胞增殖和凋亡等生物学行为。有报道称HSP90在肿瘤细胞中表达升高，而在正常细胞中表达较低[2]。HSP90抑制剂可以影响ATP酶活性导致客户蛋白降解，从而使信号传导通路停止[3]。PU-H71是近几年发现的一种新型的HSP90抑制剂，有研究介绍了PU-H71在转移性乳腺癌中的作用，通过实验证明PU-H71可以抑制肿瘤的生长，并发现PU-H71在TNF-α存在的情况下可以诱导乳腺癌细胞的死亡[4]。目前，PU-H71在结直肠癌中的作用未见相关报道，本研究将介绍PU-H71对结直肠癌HCT-15细胞周期和凋亡的影响，并且进一步探讨该药物的分子作用机制，为PU-H71的进一步开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

细胞：HCT-15细胞，实验室留存。主要试剂：PU-H71（Selleck）；RPMI-1640 培养基和DMEM培养基（Gibco）；胎牛血清（Fetal BovineSerum（Prime））；PBS（hyclone）；胰酶（Tbd）；青链霉素（Tbd）；DMSO（Sig-ma）；细胞凋亡试剂盒（KeyGEN）；细胞周期试剂盒（凯基）；BCA试剂盒（Solarbio）；抗体（Abcam）。仪器：酶标仪（BioTek）；细胞培养箱（Thermo）；显微镜；超净工作台；水浴箱；流式细胞仪（BD）；全自动化学发光仪（BD）。

1.2 主要方法

1.2.1 细胞培养 结直肠癌HCT-15细胞株用1640培养基，加入10%～15%胎牛血清和1%的双抗。放在37℃、5%CO2的恒温培养箱中，根据细胞生长状态每1～2d换液并且及时传代，待细胞达到对数生长期时可用于各项实验。

1.2.2 MTT检测PU-H71对HCT-15细胞的增殖情况 取生长至对数期的细胞，弃培养液后，用PBS清洗，加入0.25%的EDTA胰酶。细胞变圆后加入含血清的培养液缓慢吹打，将细胞收集于10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清，再加入4ml含血清的培养基，制成单细胞悬液，随后计数。将细胞密度调为1.5×104个/mL，每孔200μl，加到96孔板里，继续培养24h后取出。观察细胞状况，如果较良好，则弃去96孔板的上清液，再加入新鲜配置的培养基，每孔190μl，另外每孔再加入10μl的PU-H71，来配制成实验设计所需要的药物终浓度，每个浓度需设5个复孔，并且要设置对照组（不加药组）和空白对照组（只加含血清的培养基）。放置24h和48h后，每孔加入10μl的MTT，再放置4h，小心弃上清液，每孔加150μl的DMSO，用酶标仪检测490nm处的波长，震荡8min后，检测OD值。计算生长抑制率和IC50。实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 细胞生长到对数期后，接种于六孔板中，每孔1×106个细胞，在培养箱中放置24h。加入相应浓度的PU-H71，本实验设置的终浓度为50μg/L和75μg/L，并且设置对照组，继续培养24h。弃上清液，PBS清洗一次，然后用无EDTA的胰酶消化细胞小心吹打，将细胞收集到离心管中，1400rpm、5min离心，弃去上清，加适量PBS吹打混匀，计数，将细胞浓度调整为1×106/mL。取1ml单细胞悬液，1000rpm、4min离心，弃去上清液，加入70%的冷乙醇500μl，在4℃冰箱放置2h或者过夜。后续操作前每管加入3ml PBS清洗细胞3遍，去除残留的冰乙醇（在清洗过程中用200目筛网过滤一次），弃去上清液，加入提前配制的PI/RNase A染色工作液500μl，室温避光放置45min，1h内上机进行检测，上机之前用枪头吹打混匀并且再过一次筛网。重复实验3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期的细胞，每孔细胞数量为5×105个，接种在6孔板中。培养24h后，加入新鲜配置的PU-H71，使六孔板中浓度为50μg/L和75μg/L，再设置一组不加药组。继续培养24h，取出6孔板，每孔加入0.5ml无EDTA胰酶，轻轻吹打细胞并收集到离心管中，2000rpm、6min离心，小心弃去上清液。每管加入3ml预冷的PBS，清洗2次。制成单细胞悬液计数，取出1×105个细胞移入到流式管中，并且用200目筛网过滤一次，离心后小心弃去上清液。每管加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μl Annexin V-FITC，混匀后继续加入5μl Propidium Iodide，室温避光染色5～15min，1h内上机检测。重复实验3次。

1.2.5 蛋白质印记法 取对数生长期的细胞用胰酶消化后在培养箱中放置24h。加入新配置的PU-H71，终浓度分别为0（对照组）、50和75μg/L。24h后拿出细胞终止培养，用PBS清洗细胞3次。将细胞收集于1ml离心管中，离心弃去上清，每管加入300μl RIPA和3μl蛋白酶抑制剂，混匀，在-80℃冰箱或者液氮中反复冻融4次，12000rpm、20min收集上清，即蛋白。BCA定量完成后进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育和二抗孵育，最后用化学发光仪显影。以β-actin作内参对照。用Image J检测图像条带，得到各条带灰度值，进行统计分析。重复实验3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行相关统计学分析，用均数±标准差（）表示，以P＜0.01为差异有统计学意义。采用Graphpad Prism5对周期、凋亡及相关蛋白进行柱状图统计分析。

2 结果

2.1 MTT检测PU-H71对HCT-15细胞增殖能力的影响

PU-H71对体外培养的HCT-15细胞株作用浓度为25～150μg/L时有显著的抑制作用，且有浓度依赖性（图1）。P＜0.01表示差异具有统计学意义。

图1 不同浓度PU-H71对HCT-15细胞增殖的影响

2.2 流式细胞术检测PU-H71对HCT-15细胞周期的影响

结果显示，PU-H71作用于HCT-15细胞24h后，处于G2期细胞的比例增高，且与药物浓度呈正相关（附表、图2）。P＜0.01表示差异具有统计学意义。

附表 PU-H71对结直肠癌HCT-15细胞生长周期和凋亡率的影响

图2 不同浓度PU-H71对HCT-15细胞周期的影响

2.3 流式细胞术检测PU-H71对HCT-15细胞凋亡的影响

流式细胞术检测凋亡结果展示PU-H71作用于HCT-15细胞24h后能够有效促进肿瘤细胞凋亡，且和浓度正相关（附表、图3）。P＜0.01表示差异具有统计学意义。

图3 不同浓度PU-H71对HCT-15细胞凋亡的影响

2.4 Western-blot检测凋亡和周期相关因子蛋白水平的变化

采用Western-blot法检测PU-H71作用于HCT-15细胞后，STAT3以及凋亡和周期相关因子CyclinD1、JAK2和Bcl-2蛋白表达水平下调，Cytc、Caspase9、Caspase3、及Bax蛋白表达水平上调，且所有因子表达水平均与PU-H71的浓度呈现相关性（图4）。P＜0.05表示实验结果具有统计学意义。

图4 PU-H71对HCT-15细胞凋亡和周期相关因子的影响

3 讨论

CRC因其复发率和转移率高、早期诊断率低、治疗效果差成为人们关注的一类疾病。手术及放化疗都是目前较常见治疗结直肠癌的措施，然而，这些方法对正常细胞会产生很大的副作用。因此，新的研究正在朝着更有效和不入侵正常细胞的方向发展，来寻求最佳的治疗方式。结直肠癌的分子靶向治疗是提升疗效和降低毒性的新方法和新方向，根据目前对CRC的了解，及时检测和有效的精准治疗对于患者治疗和生存至关重要[5]。在抗肿瘤的过程中，HSP90可以调节参与肿瘤发生有关的信号通路蛋白、受体和转录因子等在内的癌蛋白和客户蛋白。HSP90有极其重要潜在的临床应用，它可以作为确诊和预后的生物标志物，来评判癌症的进展。HSP90介入了多种促癌蛋白的构象稳定和功能成熟等过程，Akhil等的研究揭示了HSP90在促进细胞周期进程中的核功能等的作用[6]。近年来，透过HSP90开发新的抗癌治疗药物，如一系列HSP90抑制剂，成为克服结直肠癌新的方向。PU-H71是一种新发现的HSP90抑制剂的衍生物，是一种嘌呤-支架型抑制剂，相较其他HSP90抑制剂展示出了独特的选择性结合优势，它可以优先与致癌客户蛋白相关，并富集于肿瘤细胞。有研究表明，PU-H71可引起内质网应激反应，进而激活不同人类癌细胞的线粒体凋亡途径，且PUH71能够诱导过表达Bcl-2的细胞凋亡，这种抵抗力在化疗中具备重要意义[7]。PU-H71具有高水溶性和低肝毒性，这些优势赋予了它更具潜力的应用前景。

我们选用HCT-15细胞，通过MTT法检测到PU-H71对HCT-15细胞增殖有鲜明的抑制作用，且呈剂量依赖性。本实验设置两个浓度以及不加药组共3组，流式实验结果显示，药物浓度加大后，凋亡率增加且细胞阻滞在G2期。线粒体作为负责能量代谢的场所，其通路在诱导细胞凋亡通路中发挥重要作用。细胞发生凋亡时，线粒体中的Cytc进入到细胞质，经过ATP的作用，和Apaf-1结合形成凋亡小体，经过活化等过程形成Caspase9前体，然后激活Caspase3，使DNA分子片段化，细胞最终凋亡。Bcl-2蛋白家族可在线粒体通路中发挥作用，引起Caspase的激活，从而导致细胞凋亡。Bax基因是Bcl-2基因家族中起促凋亡作用的成员，它编码的一种与Bcl-2有关的Bax-alpha蛋白，在调节细胞凋亡层面起着关键作用。本研究采用Westernblot法进行检测，显示Cytc、Bax、Casepase3和Casepase9表达增高，Bcl-2表达降低。CyclinDl属于周期相关因子，它在正常组织细胞中不表达或低表达，但是在肿瘤组织细胞中表达增高。本实验检测到CyclinD1蛋白表达较不加药组降低，但两个浓度之间区别不明显，需后续实验继续探讨。信号转导和转录激活因子3（STAT3）属于STAT家族成员，在细胞生长和分化中发挥重要作用，它几乎在所有体细胞中普遍表达，通过调控其下游靶基因Bcl-2、BclxL、cyclin等，在促进细胞增殖、分化、细胞周期进程、转移、血管生成和免疫抑制以及化疗耐药中发挥重要作用[8]。STAT3在大多数研究中被称为原癌基因，它的组成性激活与多种癌症的发展有关，例如白血病和淋巴瘤等恶性肿瘤[9]。JAK-STAT3信号通路是受细胞因子刺激而产生的信号转导通路，与细胞增殖、分化和凋亡等重要生物学过程都密切相关。在肿瘤发展过程中JAK-STAT3通路有着重要的作用，Su等的研究证明了brevilin A在体外和体内通过JAK2/STAT3通路的抑制发挥抗黑色素瘤作用[10]。本实验中JAK2和STAT3蛋白表达都降低，提醒我们PU-H71有可能通过该通路发挥作用。

综上所述，本研究证明了PU-H71对HCT-15细胞的增殖有抑制作用，并且可以促进细胞凋亡和阻滞细胞周期，并进一步探讨了该药对结直肠癌细胞凋亡和周期的分子作用机制。其中，线粒体凋亡通路中Cytc、Caspase3、Bax和Caspase9表达水平均上升，提示PU-H71通过线粒体途径诱导HCT-15细胞凋亡，而STAT3表达水平降低，所以我们猜测PU-H71可能通过STAT3途径启动线粒体凋亡通路，诱导HCT-15凋亡。本实验中STAT3和JAK2表达均下降，我们预测PU-H71可能通过JAK-STAT3信号通路使HCT-15细胞周期发生阻滞，并且使STAT3的表达下调来达到负向调控JAK-STAT3信号传导通路的作用。我们接下来将进一步探讨PU-H71的抗肿瘤作用及其涉及的通路和机制等，为PU-H71应用于临床提供数据依据和寻找更有效的分子靶点。