长链非编码RNA对肺结核的诊断效能Meta分析*

郑绪香，施绍瑞，汪顺伟，余 燕，杨学强，廖 婧，解学龙，聂 滨

宜宾市第二人民医院检验科，四川宜宾 644000

结核病是由结核分枝杆菌引起的以呼吸道感染为主的重大慢性传染性疾病,分为肺内结核和肺外结核，肺结核根据痰涂片是否能检出结核分枝杆菌，分为活动性肺结核和非活动性肺结核。据世界卫生组织(WHO)统计数据报告，在全球范围内，结核病是导致死亡的十大原因之一，也是传染病致死的主要原因。2019年全球新发结核病患者约996万，其中我国2019年新发结核病患者约为83.3万，结核病发病率约为58/10万(2018年约为61/10万)[1]。结核病确诊依赖病原学诊断，培养是病原学诊断的金标准，但该方法由于培养时间长，通常为5～8周，以至于很难及时诊断及治疗[2]。因此，探索一种高灵敏度、高特异度，且可广泛使用的诊断方法及标志物具有重要临床意义。

长链非编码 RNA(lncRNA)是一类不编码蛋白质、长度超过200个核苷酸的非编码RNA，占非编码RNA的80%～90%，并广泛参与机体内几乎所有的生理、病理过程，能够在表观遗传、基因的转录和转录后，以及基因翻译等多个层面上发挥调控作用[3]，并参与机体相关免疫调控[4]。有研究显示，lncRNA可稳定存在机体外周血中，其表达水平可用于疾病的早期诊断和预后评价，其中循环lncRNA与结核病的发生、发展有密切联系，可作为诊断结核病的潜在生物标志物[5-6]。但目前对lncRNA诊断的准确性尚无统一结论。因此，本文采用 Meta 分析方法系统评价lncRNA 对结核病的诊断效能。

1 资料与方法

1.1资料来源 检索 PubMed、Web of Science、Embase、SinoMed、The Cochrane Library、中国知网、万方、维普数据库，搜索关于lncRNA在肺结核研究中的相关文献，检索时间从建库至2021年1月。中文检索词包括：肺结核、结核、结核病、结核分支杆菌、长链非编码RNA、长链非编码rna等。英文检索词包括：tuberculosis、Tuberculoses、Kochs Disease、Mycobacterium tuberculosis Infection、Long Noncoding RNA、lncRNA、Long ncRNA等。

1.2文献纳入及排除标准 纳入标准：(1)公开发表的有关lncRNA方法诊断肺结核的准确性的横断面研究、队列研究、随机对照试验等，不限定研究类型，发表时间为建库至2021年1月，语言为英文和中文；(2)研究对象为临床确诊的肺结核患者；(3)标本来源为外周血或血清；(5)文献明确阐明是研究循环lncRNA与结核病诊断的关系，并能完整提取四格表数据，包括真阳性、假阳性、真阴性、假阴性。排除标准：(1)重复发表文献；(2)研究对象为细胞系基础研究或动物实验等；(3)标本来源为组织或其他体液的lncRNA；(4)综述、病例报告、会议记录、评论性文献等；(5)无法获取全文、缺乏原始数据或其他关键信息。

1.3文献筛选和资料提取 由2名研究人员通过阅读文献摘要、文献全文，根据纳入和排除标准，确定纳入研究文献，然后进行数据提取。如有异议，通过讨论或与第3位研究者讨论共同确定。根据文献研究，需要提取内容包括：第一作者、发表年限、国家、标本类型、研究人群、病例组及对照组数量、lncRNA类型、灵敏度、特异度、受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)。

1.4文献质量评价 纳入研究文献后，使用Revman5.0诊断试验质量评价工具(QUADAS)-2[7]进行质量评价，包括病例选择、待评价诊断试验、金标准试验、研究流程和进展情况4个项目。偏移风险评价中对每项研究中的问题判断为“是、否或不清楚”；“是”表示偏倚风险低，“否”表示偏倚风险高，“不清楚”表示信息不足[8]。对文献临床适用性采用“低风险、高风险、不清楚”进行评价。

1.5统计学处理 通过Meta-disc软件计算纳入研究之间的Spearman相关系数(r)，判断是否存在阈值效应，P>0.05说明不存在阈值效应。若无阈值效应则通过对诊断数据的进行合并分析，判断其诊断价值；若存在阈值效应，仅通过绘制集成ROC(SROC)曲线并计算AUC来判断诊断价值。使用Stata15.0进行统计学分析，采用双变量混合效应模型[9](“midas”程序包)对灵敏度、特异度等进行合并统计分析。所有结果均以合并值和95%CI表示。通过Q检验结合I2判断统计学异质性大小，当P<0.05或I2≤50%，说明纳入研究间异质性较小；当P>0.05或I2>50%，说明纳入研究间异质性较显著，需进一步分析异质性来源[10]。可根据标本类型、病例组样本量大小、发表年限等进行Meta回归和亚组分析,当P<0.05证明是导致异质性来源。使用Stata15.0制作Deeks漏斗图评价文献发表偏移，当P>0.1表示无发表偏移，P<0.1提示存在发表偏移。

2 结 果

2.1文献筛选流程及结果 初筛共纳入329篇，最终纳入12篇文献[11-22]。其中包括4篇英文文献，8篇中文文献。

2.2纳入研究的基本特征及质量学评价 本研究共计纳入12篇文献累计1 145例患者和1 585例对照者。文献发表年限为2017-2020年，其中关于活动性肺结核研究为7篇[11,13-15,20-22](共计有活动性肺结核16个比较组)；6篇为肺结核研究组[12,15-19](共计7个比较组)，患者为符合肺结核诊断标准患者，未标明进一步结核感染分类。纳入文献基本特征见表1。利用QUADAS-2对文献进行质量评价,由于研究中文献均采用病例-对照研究，因此导致病例选择均为“高风险”，但仍属于研究范畴。在活动性肺结核及肺结核未分类组中的诊断标准各异，未设定阈值，所以在待评价诊断试验中多数为“不清楚”。在诊断标准，研究流程及进展情况中多数为“低风险”。临床适用性方面，两组纳入文献在均为“低风险”较多。

表1 纳入研究基本特征

2.3Meta分析结果

2.3.1lncRNA诊断肺结核的准确性及灵敏度分析 lncRNA合并诊断活动性肺结核中，Spearman相关系数r=-0.087(P=0.749>0.05)，结果显示活动性肺结核组无阈值效应。采用双变量混合效应模型进行合并计算，结果显示lncRNA合并诊断灵敏度为0.75(95%CI：0.67～0.82)，特异度为0.87(95%CI：0.80～0.91)，阳性似然比为5.61(95%CI：3.62～8.70)，阴性似然比为0.28(95%CI：0.21～0.39)，见表2。SROC 曲线 AUC 为0.88(95%CI：0.85～0.91)。仅诊断为肺结核组中，Spearman相关系数r=0.918(P=0.004<0.05)，表明肺结核(未分类)存在阈值效应，lncRNA诊断结果使用SROC曲线的AUC表示，AUC为0.80(95%CI：0.76～0.83)。将肺结核组(未分类)与活动性肺结核组结果使用Stata15.0进行灵敏度分析，剔除可能导致异质性文献后，重新进行Meta分析，结果显示灵敏度和特异度均未见明显变化，表明本研究结果较稳定，结果可信度高。

表2 lncRNA合并诊断活动性肺结核灵敏度、特异度及似然比

2.3.2Meta回归分析及亚组分析 活动性肺结核组I2检验结果显示：灵敏度、特异度中I2检验结果分别为90.54%、94.87%(均>50%)，Q检验结果显示P<0.05,因此活动性肺结核组异质性较大，需进一步探讨其非阈值效应的异质性来源。对标本类型、病例组样本量大小、发表年限及标本类型进行Meta回归分析，通过单变量Meta回归分析结果显示，纳入异质性可能来源于病例组纳入样本量大小、标本类型、RNA提取方法(P<0.05)；亚组分析结果显示，小样本量组的AUC高于大样本量组，RNA提取方法亦可能是造成异质性的原因，对文献结果有一定的影响。见表3。

2.3.3发表偏移 使用Stata15.0制作Deeks漏斗图，结果显示活动性肺结核组存在发表偏移(P<0.1)，而未分类肺结核组不存在发表偏移(P>0.1)。见图1。

表3 lncRNA诊断活动性肺结核亚组分析

续表3 lncRNA诊断活动性肺结核亚组分析

注：A为活动性肺结核组发表偏移，研究点1～16分别为陈敏等-1[11]、陈敏等-2[11]、罗杰-1[13]、罗杰-2[13]、罗杰-3[13]、罗杰-4[13]、杨晓帆-1[14]、杨晓帆-2[14]、杨晓帆-3[14]、赵继利-4[15]、罗清[22]、宋佳佳等-1[21]、房雅伦-1[20]、房雅伦-2[20]、房雅伦-3[20]、房雅伦-4[20]的研究；B为肺结核组发表偏移，1～7分别为SUN等[16]、HU等[17]、CHEN等[18]、SUN等[19]、胡玉婷-4[12]、赵继利-1[15]、赵继利-3[15]的研究。

3 讨 论

目前结核病筛查及诊断的方法有涂片染色、培养、结核菌素试验(TST)、T细胞酶联免疫斑点法(T-SPOT)、γ干扰素释放试验(IGRA)等。在活动性肺结核阶段，痰涂片及痰培养能较好发现病原菌，但阳性率均较低[24]，且该阶段患者已属结核病的中晚期。这些常用方法在早期诊断中作用甚微。结核的早发现、早诊断、早治疗有利于降低患者感染率、病死率。因此寻找一种操作简洁，灵敏度、特异度高的快速检测方法及标志物显得尤为重要。

lncRNA占所有非编码RNA的80%，其特点之一是其细胞水平低于编码蛋白质的RNA，且具有较高的组织特异性[25]。欧叶青等[26]发现，lncRNA在潜伏性结核感染患者血浆中有1 485个lncRNA差异表达，其中上调819个，下调666个。而罗杰等[13]研究表明，lnc-FAM110B、lnc-GUCY2C-1、NEAT1、MALAT1 4个标志物联合应用区分健康对照组和活动性肺结核组的AUC达0.87。lncRNA在活动性肺结核、潜伏性肺结核及耐多药肺结核中均有差异表达，并有较高诊断价值，然而目前尚无统一标准。

本文回顾目前发表的关于lncRNA在肺结核方面的临床研究，探讨lncRNA在活动性肺结核及肺结核未分类患者中的诊断价值。通过Spearman相关系数判断在活动性肺结核组中不存在阈值效应(P>0.05)，使用Stata15.0合并灵敏度等结果显示，lncRNA在活动性肺结核中有较高的灵敏度和特异度，合并阳性似然比为5.61(95%CI：3.62～8.70)，说明活动性肺结核患者检出阳性结果是非患者的5.61倍。合并阴性似然比为0.28(95%CI：0.21～0.39)，说明活动性肺结核患者阴性结果是非结核患者的0.28倍。SROC 曲线的AUC 为0.88(95%CI：0.85～0.91)，该结果显示lncRNA对于活动性肺结核诊断具有较好的诊断价值。I2检验结果显示，在活动性肺结核组纳入的文献中有较高的异质性，进行回归和亚组分析后，亚组分析结果显示异质性来源为标本量大小及lncRNA提取方法，Meta分析结果显示当病例数<40时，诊断价值更高，因此在未来研究中，应提高病例组人数，并且根据研究要求选择合适的RNA提取方法，避免过低或过高的估计lncRNA在活动性肺结核中的诊断价值。Meta分析结果显示，因诊断为肺结核组中Spearman系数结果显示存在阈值效应(P<0.05)，通过SROC 曲线计算 AUC 为0.80(95%CI：0.76～0.83),结果显示lncRNA在肺结核未分类组中，具有较好的诊断价值。活动性肺结核组漏斗图提示具有一定的偏移性，分析原因可能有：(1)文献中大多为小样本研究；(2)文献异质性太大可能对发表偏移有一定的影响。肺结核组中不存在文献发表偏移。

本篇文献存在一定局限性：文献中主要检索了中文和英文文献，可能存在语言偏移；文献的研究地区均为中国地区，可能代表性不高；在筛选出的文献中，均为病例-对照研究，未能遵循盲法试验，可能对文献质量评价以及对研究结果造成偏移。

综上所述，lncRNA用于活动性肺结核及肺结核患者的诊断具有较好诊断价值，且lncRNA在活动性肺结核中有较高的灵敏度和特异度，但其临床价值仍需大量的高质量研究来验证。