归元剔络养血方对NAION模型大鼠VEGF调控作用的研究

李欣，李雪菲，侯文博，冯俊

非动脉炎性前部缺血性视神经病变(nonanteritic anterior ischemic optic neuropathy，NAION)是由于睫状后短动脉循环障碍，造成视盘的筛板前区及筛板区供血不足引起的视神经疾病。其主要症状特点是视力突然减退、视乳头水肿、与生理盲点相连的象限性视野缺损。NAION 的发病人群以45 岁以上者为主，其发病突然，对视功能造成不同程度的损害，是危害中老年人视功能的重要原因之一[1]。目前仍缺乏有效改善NAION 的视功能的治疗方法[2]。本课题组前期临床观察发现归元剔络养血方能有效改善NAION 患者视力、视野，以及患者视神经血液供应[3-4]，但其具体机制不明确。血管内皮生长因子(vasculaur endothelial growth factor，VEGF)在缺血缺氧情况下表达显著，广泛参与缺血性脑卒中、心肌缺血及年龄相关性黄斑变性、糖尿性视网膜病变等多种疾病，在减轻氧化应激损伤、促进血管新生、抑制细胞凋亡、保护神经等方面发挥重要作用[5-7]。VEGF 在NAION 中的作用尚不明确。本研究拟探讨NAION 大鼠VEGF 表达情况，及归元剔络养血方对VEGF 的调控作用，探讨其治疗NAION的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康的Spargue-Dawley (SD) 雄性大鼠72 只，体重160～180 g，SPF 级别[购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0006]。由中国中医科学院眼科医院实验动物中心饲养，饲养条件：12 h/12 h 交替光暗，温度25℃，湿度55%左右，自由饮食、饮水，动物房环境保持安静、通风良好。所有实验操作遵循《北京市实验动物管理条例》，并按实验动物3R 原则给予人道关怀。实验前在散瞳条件下检查SD 大鼠双眼前节和眼底，排除屈光间质和眼底异常的大鼠。

1.2 药品、试剂与仪器

归元剔络养血方水煎剂(组成：当归、土鳖虫、黄芪、川芎、桃仁、红花、茯苓、甘草，由中国中医科学院眼科医院药剂科煎制），煎制浓缩到2 g/mL；4%水合氯醛溶液(国药集团，H37022673)；复方托吡卡胺滴眼液(日本参天制药有限公司，MP2234）；盐酸奥布卡因滴眼液(日本参天制药有限公司，B2121)；氧氟沙星眼膏(日本参天制药有限公司，TRN3138)；孟加拉玫瑰红(美国Sigma 公司，632-69-9)；荧光素钠注射液(广州白云山明兴制药有限公司，10V13)；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司，C-101)；VEGF免疫组化试剂盒(中国迈新，KIT-9710)；大鼠VEGF酶联免疫吸附测定试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司，138361135)。

氪激光机(美国Lumenis 公司，532nm 激光器)；眼底血管造影机(日本Topcon 公司，TRC.50DX)；石蜡切片机(德国Leica 公司，RM2235)；石蜡切片摊片机(德国Leica 公司，HI1210)；石蜡切片烘片机(德国Leica公司，HI1220)；全自动脱水机(德国Leica公司，ASO300S)；光学显微镜(德国Leica 公司，DM2500)；90 D 前置镜(美国Ocular 公司)；全自动多功能酶标仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司，THERMO Multiskan MK3]；电热恒温培养箱(天津泰斯特公司，DH4000A)；微型震荡器(江苏其林贝尔公司)。

1.3 动物模型的建立、分组及给药

SD 雄性大鼠24 只，右眼为实验眼，采用光动力方法[8]制备NAION 大鼠模型：复方托吡卡胺滴眼液点眼散瞳；4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉；大鼠尾静脉注入孟加拉红后，立即将大鼠置于激光机前，瞄准光对准视盘进行照射(激光参数:波长532 nm，能量75 mW，光斑直径500 μm，照射时间18 s)。注入孟加拉红与激光照射结束的时间控制在1 min 以内。随机分为模型组和中药组，每组各12只。造模第2 d 每组随机抽取4 只大鼠行右眼眼底彩色照相及眼底荧光造影检查，存在视盘水肿，视盘早期低荧光、晚期荧光素渗漏者标志造模成功，未成模者剔除。中药组每日予30 g/kg 归元剔络养血方3 mL灌胃；模型组大鼠每日给予同体积蒸馏水灌胃1次。取正常未干预SD 雄性大鼠12 只为正常组，常规饲养作为对照。给药第10 d 处死大鼠，进行实验指标测定。

1.4 视网膜、视神经组织病理学改变

给药后第10 d每组颈椎脱臼法随机处死4只大鼠，快速摘取眼球，保留约2 mm 长视神经；去除眼前节和玻璃体，视网膜视神经组织固定24 h，梯度酒精脱水、二甲苯透明后浸蜡包埋；作过视神经的矢状面连续切片，厚度4 μm切片；切片常规脱蜡、水化后行HE 染色，光学显微镜观察视神经、视网膜各层病理改变，并照相记录。

1.5 免疫组织化学法测定大鼠视网膜VEGF表达

随机选取给药第10 d 各组大鼠石蜡切片3 张，常规脱蜡，水化，抗原修复，血清封闭；一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育，二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）显色5～10 min，苏木精复染后脱水、透明、封片，光镜下观察组织VEGF 的表达。应用Image-Pro Plus 6.0软件测量平均光密度值。

1.6 ELISA 法检测大鼠玻璃体和外周血VEGF 的表达

给药第10 d，各组随机选取8 只大鼠，腹腔注射4%水合氯醛(1 mL/100 g)，待全身肌肉松弛，呼吸平稳；迅速摘出右侧眼球。打开腹腔，于腹主动脉抽取全血约1 mL。0.9%氯化钠注射液漂洗眼球表面血液成分；去除大鼠角膜、晶状体，取出玻璃体，置于无菌EP 管中；加0.9%氯化钠注射液，手工匀浆，制备10%匀浆液；低温低速离心，2,500转/min，时间10～15 min，取上清液制备成玻璃体组织匀浆，酶联免疫双抗体夹心法测定玻璃体内VEGF 含量。将外周血静置，离心，2,500 转/min，时间10 min；吸取上清液300 μL 至EP管。应用酶联免疫双抗体夹心法测定血清VEGF含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS20.0 统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差()表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼底形态学改变

造模第2 d，眼底彩色照相（图1）显示NAION 大鼠视盘边界模糊；视网膜荧光血管造影显示视盘脉络膜充盈不良，视盘血管异常荧光素渗漏（图2），与NAION临床表现一致。

图1 NAION模型大鼠眼底形态学改变。

图2 大鼠视网膜荧光血管造影

2.2 大鼠视网膜组织病理学改变

HE 染色显示正常大鼠视网膜外核层（outer nuclear layer，ONL）、内核层(inner nuclear layer，INL)、视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）、视神经纤维层（retinal nerve fiber layer，RNFL）各层组织结构完整，层次清晰，RGCs 排列有序、致密，RNFL 平铺于RGCs 表面；10 d 时，模型组RNFL 水肿、RGCs 丢失 明显；中药 组RNFL 水肿，RGCs少量丢失（图3）。

图3 3组大鼠视网膜组织病理学改变（HE染色，×200）

2.3 大鼠视网膜VEGF表达

正常组大鼠浅层视网膜血管有少量VEGF 表达。模型组、中药组浅层视网膜血管、视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）层可见VEGF表达（图4）。

图4 3组大鼠视网膜VEGF表达（免疫组织化学染色，×200）

组间视网膜VEGF 平均光密度差异存在统计学意义（F=19.851，P=0.004）；模型组视网膜VEGF 平均光密度（0.17±0.02）较正常组（0.07±0.02）升高（t=6.299，P=0.001）；中药组视网膜VEGF 平均光密度（0.13±0.01）高于正常组（t=3.646，P=0.015），低于模型组（t=-2.966，P=0.031），均有统计学意义。

2.4 ELISA 法检测大鼠玻璃体和外周血VEGF 的表达

组间血清VEGF 浓度存在统计学差异（F=5.440，P=0.018）；模型组血清VEGF浓度较正常组升高（t=2.803，P=0.014）；中药组血清VEGF 浓度较模型组降低（t=-2.787，P=0.015），差异均有统计学意义。中药组与正常组差异无统计学意义（P＞0.05）。而3 组间玻璃体VEGF 浓度比较无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 各组大鼠玻璃体、外周血VEGF浓度比较（，pg/mL，n=8）

表1 各组大鼠玻璃体、外周血VEGF浓度比较（，pg/mL，n=8）

注：*与正常组比较，P＜0.05；#与模型组比较，P＜0.05；VEGF血管内皮生长因子

3 讨论

VEGF 作为内皮细胞的特异因子广泛作用于肿瘤、缺血性疾病及炎性病变等。VEGF 家族包括VEGF A-F、胎盘生长因子（placenta growth factor，PlGF）和内分泌源性血管内皮生长因子（endocrine gland-derived vascular endothelial growth factor，EGVEGF）[9]。VEGF受体包括VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3。VEGF 的作用主要有：（1）促血管生成。VEGF 不仅参与胚胎时期的血管发育。在肿瘤、炎症、缺血、缺氧状态下，内皮细胞、肿瘤细胞、巨噬细胞、RPE 细胞、视网膜Müller 细胞、胶质细胞等分泌VEGF-A。VEGF-A 是最强的促血管生成因子。VEGF-A 与VEGFR-1相互作用，通过激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt)、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)等途径，促进血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、造血干细胞等趋化和迁移。VEGF-A 与VEGFR-2 结合，通过多种通路，参与内皮细胞的增殖；通过激活PI3K/Akt 信号转导通路，抑制内皮细胞凋亡。通过以上一系列步骤，VEGF 促进了血管形成相关细胞的增殖和迁移，诱导了病理性血管的形成。在疾病中，病理性血管生成可以增加血流灌注，改善血氧供应[10]。但同时由于其结构不完善，存在引发出血、水肿，或促进肿瘤生长等问题。（2）增加血管通透性。VEGF-A、VEGF-E 与VEGFR-2 结合，作用于某些整合素，破坏细胞之间的连接，诱导内皮细胞形成窗孔，增加血管通透性；或通过激活Akt 激酶，促进内皮细胞生成一氧化氮（nitric oxide，NO），进而扩张血管，增加血管通透性。血管通透性的增加为细胞迁移、血管生成创造条件，但同时导致血浆大分子外渗［11］，加重组织水肿、炎症反应加重。VEGF增加毛细血管通透性的作用是组胺的5 万倍。（3）保护神经元，①抑制神经元凋亡，VEGF-A、VEGF-B 可以拮抗RGCs 凋亡[12]。VEGFR-2R/PI3K/Akt是抑制神经元凋亡的重要信号转导通路[13]；②促进神经元再生，VEGF 可以直接促进神经干细胞的增生，或者促进胶质细胞转分化为新生神经元[14-16]。（4）促进淋巴管的生长。VEGF-C、VEGF-D 有促进淋巴管生长的功能。

综上分析，VEGF 具有促血管生成、增加血管通透性、保护神经、促进淋巴管生长的重要作用。眼部视网膜血管内皮细胞、RPE 细胞、Müller 细胞、星形胶质细胞、RGCs 都可以分泌VEGF[17]。在年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变及视网膜静脉阻塞等眼病中VEGF 均扮演重要角色，通过诱导血管新生和增加血-视网膜屏障通透性[18-19]，导致视网膜出血、水肿的发生，使病变加重或反复。

目前关于NAION 中VEGF 的研究尚未深入。有文献[20]报道VEGF 为影响NAION 患者的独立危险因素，与病变呈正相关。对于NAION 的抗VEGF治疗目前存在分歧[21]，有研究[22]表明玻璃体腔注射康柏西普可有效降低玻璃体内VEGF-A 水平，显著提高NAION 患者的视力和视野，有效改善临床疗效。亦有实验[23]表明玻璃体腔注射抗VEGF 药物对于NAION 没有明显的治疗作用。多次抗VEGF 治疗甚至成为患缺血性视神经病变的危险因素[24]。

本次研究观察了NAION 大鼠视网膜、玻璃体、外周血中VEGF 表达的变化，及中药复方归元剔络养血方对其调节作用。根据文献[25-27]报道，在NAION、视网膜静脉阻塞、脑缺血等病变的大鼠模型中，造模后约2 周组织VEGF 表达有差异性变化。本次研究考虑中药的起效时间，以10 d 为观察点进行取样检测。研究发现模型组大鼠视网膜VEGF 表达及外周血VEGF 浓度明显高于正常组，证明在NAION 早期存在VEGF 的高表达，这与SUN 等[25]、RANGELA 等[28]的研究一致。中药组视网膜VEGF表达及外周血VEGF 浓度均较模型组降低，说明归元剔络养血方有抑制VEGF 过度表达的作用。结合视网膜组织病理表现，中药组RNFL水肿及RGCs丢失较模型组减轻，说明归元剔络养血方可能通过抑制VEGF 过度表达，减轻其增加血管通透性的作用，进而减轻水肿和炎症反应，对视神经、视网膜组织起到保护作用，抑制了RGCs 的凋亡。本次实验中，模型组玻璃体VEGF 浓度较正常组有增高的趋势，但无统计学意义；中药组玻璃体VEGF 浓度较模型组有降低的趋势，亦无统计学意义，可能与观察时间短，或者归元剔络养血方主要在血液中发挥作用有关。后续将在此基础上，研究早期NAION 中，归元剔络养血方抑制VEGF 过度表达的机制；观察VEGF 在NAION 病变过程中的动态表达，以及归元剔络养血方对它的调控作用，系统分析归元剔络养血方对VEGF的调控作用，及治疗NAION的机制。