血清甘露糖结合凝集素、甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶-2在IgA肾病中的作用

王英杰，米 焱，王彩丽

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院肾内科，内蒙古包头 014010)

IgA肾病(IgA Nephropathy，IgAN)是常见的原发性肾小球肾炎类型,尤以亚洲地区多见[1]。IgAN起病隐匿，临床进展各不相同，首次临床表现后20～30年，有30 %～40 %的患者发展到终末期肾脏疾病[2]。IgAN患者的死亡风险增加，平均预期寿命减少6年[3]。IgAN发病机制复杂，被认为是一种由免疫介导的疾病。近年来研究表明补体甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)途径参与IgAN发生发展[4]，但确切机制尚未完全清楚，且其相关组分在疾病中的表达情况及意义仍无一致性结论。MBL途径的活性主要取决于MBL和MBL相关丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine proteases, MASP)-2浓度[5]。本研究通过检测IgAN患者外周血循环中MBL及MASP-2浓度，重点分析其与临床指标、病理指标的关系，探讨MBL途径关键分子MBL、MASP-2在IgAN中的作用。

1 对象与方法

1.1对象 选取2020年12月～2021年12月在包头医学院第一附属医院肾内科行肾穿刺活检病理诊断为IgAN的患者33例为IgAN组，男性12例，女性21例，平均年龄(36.00±20.00)岁。选取同期体检的健康志愿者33例为对照组，男女比例与IgAN组一致，平均年龄(35.00±17.00)岁，体检指标正常，无肾病、自身免疫性疾病、感染性疾病、糖尿病、肿瘤疾病。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象在参与研究时均签订知情同意书。

纳入标准：(1)光镜报告中肾活检组织可见肾小球数≥10个；(2)免疫荧光肾小球系膜区以IgA沉积为主，符合IgAN的诊断；(3)肾脏穿刺时eGFR≥15 mL/(min·1.73m2)。排除标准：(1)未满18周岁；(2)妊娠期；(3)既往使用过激素或免疫抑制剂；(4)继发性IgAN，如过敏性紫癜；(5)伴发系统性红斑狼疮、干燥综合征、强直性脊柱炎、糖尿病、糖尿病肾病、病毒性肝炎、肝硬化、肿瘤、艾滋病以及存在泌尿道感染等疾病。

1.2方法

1.2.1一般资料 收集整理IgAN组患者的一般资料，包括性别、年龄、疾病史、是否患高血压。临床指标：血尿、24h尿蛋白定量(24 hours urinary protein，24hUP)、血白蛋白(albumin，ALB)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血尿酸(uric acid，UA)、估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesferol，LDL-C)、血沉(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)、血清免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)、血清免疫球蛋白A(Immunoglobulin A，IgA)、血清免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)、血清补体C3(Complement 3，C3)、血清补体C4(Complement 4，C4)。肾活检报告信息：牛津分型中MEST-C[6]评分，肾小球IgG、IgA、IgM、C3免疫荧光沉积强度。

注 ：①高血压：根据中国肾性高血压管理指南2016(简版)[7]进行诊断。②血尿：高倍镜尿沉渣镜检红细胞计数<3个为“-”，计为“0”；3-9个为“±”，计为“1”；10-19个为“+”，计为“1”；20-29个为“++”，计为“2”；30-39个为“+++”，计为“3”；≥40个为“++++”，计为“4”。③牛津分型[6]MEST-C评分：M表示系膜细胞增殖(光镜下50 %及以上的肾小球系膜区不足3个系膜细胞为M0，50 %及以上的肾小球系膜区3个及以上系膜细胞为M1)，计“M0、M1”；E表示肾小球毛细血管内增生(无为E0，有为E1)，计“E0、E1”；S表示肾小球节段硬化(无为S0，有为S1)，计“S0、S1”；T表示肾小管萎缩/间质纤维化(肾小管萎缩/间质纤维化受累面积≤25 %为T0，26 %～50 %为T1，>50 %为T2)，计“T0、T≥1(肾小管萎缩/间质纤维化受累面积>25 %)”；C表示细胞/纤维细胞性新月体(无新月体为C0，至少有1个肾小球有新月体，且有新月体肾小球的<25 %为C1，≥25 %的肾小球有新月体为C2)，计“C0、C≥1(有新月体)”。④肾小球IgA、IgG、IgM、C3免疫荧光沉积强度：用“-、1+、2+、3+、4+”表示，计为“0、1、2、3、4”。⑤eGFR使用中国校正简化MDRD公式计算。

1.2.2血清采集及处理 在肾活检(IgAN组)或纳入研究(健康对照组)当日用一次性无菌干燥真空促凝管取空腹外周静脉血4～5 mL，1 h内进行离心(3 000 r/min，10 min)，取上层血清分装于2 mL无酶EP管，超低温冰箱-80 ℃恒温保存，待测。

1.3试剂及检测方法 所用人MBL、MASP-2 ELISA检测试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行检测，按照人MBL、MASP-2 ELISA检测试剂盒使用说明书进行操作。使用酶标仪(450 nm波长下)测定吸光值(OD值)，分别计算得到两组血清标本MBL及MASP-2浓度。

2 结果

2.1两组血清MBL浓度比较 IgAN组(IgAN)血清MBL浓度服从正态分布、健康对照组(Control)血清MBL浓度呈偏态分布。IgAN组(IgAN)血清MBL浓度为(1 096.99±584.73 )ng/mL，健康对照组(Control)血清MBL浓度为453.50(363.16,1 092.06)ng/mL。IgAN组(IgAN)血清MBL浓度高于健康对照组(Control)，两组间差异有统计学意义(P=0.03)。见图1。

图1 健康对照组与IgAN组血清MBL浓度比较

2.2两组血清MASP-2浓度比较 IgAN组(IgAN)、健康对照组(Control)血清MASP-2浓度均不服从正态分布。IgAN组(IgAN)血清MASP-2浓度为435.41(248.22,649.99)pg/mL，健康对照组(Control)血清MASP-2浓度为396.59(107.40,637.42)pg/mL。IgAN组(IgAN)血清MASP-2浓度与健康对照组(Control)组间差异无统计学意义(P=0.33)。见图2。

2.3血清MBL与MASP-2浓度的相关性分析 IgAN组的血清MBL浓度与MASP-2浓度呈正相关(r=0.40，P=0.02)；健康对照组的血清MBL浓度与MASP-2浓度呈负相关(r=-0.60，P=0.00003)。

2.4IgAN患者血清MBL、MASP-2浓度与一般资料的相关性分析 IgAN患者血清MBL、MASP-2浓度与年龄、性别及是否患高血压均无相关性。见表1。

图2 健康对照组与IgAN组血清MASP-2浓度比较

表1 IgAN患者血清MBL、MASP-2浓度与一般资料的相关性分析

2.5IgAN患者血清MBL、MASP-2浓度与临床指标的相关性分析 IgAN患者血清MBL浓度与24hUP呈正相关(r=0.36，P=0.04)、与LDL-C水平呈正相关(r=0.49，P=0.004)、与UA水平呈正相关(r=0.35，P=0.048)，与ALB水平呈负相关(r=-0.35，P=0.048)。IgAN患者血清MBL浓度与血尿、Scr、BUN、eGFR、TG、LDL-C、ESR、血清IgG、血清IgA、血清IgM、血清补体C3、血清补体C4均无显著相关性。IgAN患者血清MASP-2浓度与ESR呈正相关(r=0.51，P=0.005)。IgAN患者血清MASP-2浓度与血尿、24hUP、Scr、BUN、eGFR、TG、LDL-C、ESR、血清IgG、血清IgA、血清IgM、血清补体C3、血清补体C4均无显著相关性。见表2。

2.6IgAN患者血清MBL、MASP-2浓度与病理指标的相关性分析 IgAN患者血清MBL浓度与T0呈负相关(r=-0.352，P=0.045)，IgAN患者血清MBL浓度与T≥1呈正相关(r=0.352，P=0.045)。IgAN患者血清MBL浓度与M0、M1、E0、E1、S0、S1、C≥0、C≥1无相关性，与肾小球IgG、IgA、IgM、C3的沉积强度无相关性。IgAN患者血清MASP-2浓度与M0、M1、E0、E1、S0、S1、T≥0、T≥1、C≥0、C≥1病变无相关性，与肾小球IgG、IgA、IgM、C3的沉积强度亦无相关性。见表3。

表2 IgAN患者血清MBL、MASP-2浓度与临床指标相关性分析

表3 IgAN患者血清MBL、MASP-2浓度与病理指标的相关性分析

3 讨论

补体MBL途径是免疫系统的重要组成，MBL是激活该途径的启动因子，被认为是一种急性时相反应蛋白。在病原体感染的早期，MBL由肝细胞诱导产生，能与病原体表面甘露糖残基结合，活化MASPs，其中MASP-2是该途径的主要酶，能裂解C4和C2，级联激活补体末端通路，形成攻膜复合物发挥生物学作用。尽管MBL途径是机体免疫系统的防御机制，但也可能在疾病进展中发挥不利的作用。目前被广泛认同的是补体MBL途径参与IgAN发生发展，但其相关分子在IgAN中的表达及意义尚存在争议。

本研究发现IgAN患者血清MBL浓度较健康志愿者高，与朱林波[8]IgAN 患者组(186例)血清MBL水平高于健康对照组的研究结果一致，提示血清中高浓度的MBL可能参与IgAN疾病过程。根据MBL在免疫反应早期识别并结合N-乙酰半乳糖胺的特性，推测MBL在IgAN患者血清中浓度偏高可能与其在疾病早期或者疾病活动状态激活增多有关。

但也有研究[9-10]未发现IgAN患者血MBL浓度与健康人群间有差异。IgAN患者血MBL水平可能会受到种族、地域、环境因素的影响。国内Guo等[11]同样未发现IgAN患者与健康人群血MBL浓度的差异，但发现血MBL水平较低的IgAN患者感染和血尿的发生率较高，而MBL水平过高的IgAN患者有更严重的蛋白尿和高新月体比例。

本研究未观察到IgAN患者血清MBL浓度与血尿及肾小球新月体的相关性，但观察到IgAN患者血清MBL浓度高于健康志愿者，且高水平的血清MBL与尿蛋白定量、血白蛋白水平及高尿酸血症相关，血清MBL水平升高可能预示IgAN疾病进展。

本研究还关注到IgAN组血清MBL浓度与低密度脂蛋白胆固醇水平呈正相关。“脂质肾毒性假说”认为慢性进行性肾病可能是由脂质代谢异常介导的，肾脏疾病伴发血脂异常，血脂异常加重肾组织损伤。近期也有报道[14]称较高的低密度脂蛋白胆固醇水平与显著较高的慢性肾脏病进展风险相关。因此推测MBL途径异常活化协同脂代谢异常导致IgAN肾组织损伤。

不仅如此，相关性分析显示IgAN患者血清MBL浓度与T0及T≥1均存在相关关系，提示高浓度的血清MBL可能参与IgAN肾小管/间质损伤，肾小管萎缩/间质纤维化被认为是反应IgAN疾病严重程度的重要指标之一[15]，因此推测循环中较高浓度的MBL可能通过参与肾小管/间质损伤加重IgAN疾病过程。

目前关于MASP-2在IgAN患者血清中表达的研究尚少。本研究与郑林花等[16]的研究结果一致，同样未发现IgAN组与健康对照组间血清MASP-2浓度有统计学差异。但郑林花等[16]的研究发现血清MASP-2浓度较低的IgAN患者肉眼血尿发生率较高，而血清MASP-2浓度较高的IgAN患者尿蛋白较多、肾小球系膜增生更明显，他们认为过多或过少的MASP-2激活似乎都对IgAN发生发展产生有害影响，此外，生存曲线分析显示过高或过低的血清MASP-2浓度均导致患者肾脏生存率偏低，与Guo等[11]观察到的MBL在IgAN患者循环中表达的特点相似。遗憾的是，本研究中未观察到血清MASP-2浓度与血尿、蛋白尿、肾功能及病理指标间的相关性。本研究发现IgAN患者中高浓度血清MASP-2与更快的血沉相关，血沉增快可能与补体MBL途径激活导致疾病处于慢性炎症状态有关。

值得重视的是，正常生理状态下补体系统精密而平衡，MASP-2由MBL活化后激活，均为MBL途径的关键组分，其表达水平似乎应该存在较强的相关关系，但本研究中IgAN组患者血清MBL与MASP-2仅呈弱的正相关(r=0.40)，而在健康对照组中观察到了强的负相关(r=-0.60)。猜测一, IgAN患者血MASP-2浓度可能随MBL的过度活化而增高，而在健康人血液循环中,相对较低水平的MBL可能对MASP-2的产生存在某种程度的抑制，推测MBL与MASP-2表达水平的失衡或是两者间的“稳态”被打破，可能诱导或推进MBL途径的异常活化，这会不会是IgAN发生发展的机制之一。猜测二，尽管MBL途径主要模式识别分子是MBL，还有其他多种模式识别分子参与补体途径的激活，可以活化MASPs，因此猜测在IgAN中可能还有其他模式识别分子参与MASP-2的活化，并可能在该病中起一定作用。猜测三，MBL具有多种复杂的功能，不仅仅参与MBL途径，因此MBL可能在IgAN患者的循环中还参与其他肾损伤机制，均有待进一步研究的证实。

综上，补体MBL途径参与IgAN的疾病过程，高浓度血清MBL在IgAN患者尿蛋白排泄增多、血白蛋白降低、嘌呤代谢异常以及脂代谢异常、肾小管/间质损伤中起重要作用，提示高浓度的血清MBL可能是IgAN发生发展的重要因素。高水平的血清MASP-2伴随血沉更快，可能是IgAN中持续的MBL途径激活及疾病慢性炎症状态的结果。