活血胶囊抑制H2O2诱导的小鼠主动脉平滑肌细胞衰老的研究

霍雪萍，曹情雯，王海芳，赵向绒，王 晶，董 静，马运峰

(1. 西安交通大学医学部基础医学院，陕西 西安 710061；2. 陕西省中医医院，陕西 西安 710003；3. 陕西中医药大学陕西省中西医结合心血管病防治重点实验室，陕西 西安 712046；4. 陕西省人民医院，陕西 西安 710068；5. 陕西中医药大学第二附属医院，陕西 西安 712000)

动脉粥样硬化是一种以动脉粥样硬化斑块形成为特征的血管慢性炎症性疾病，血管衰老在其进展中起着重要作用[1]。动脉粥样硬化斑块的纤维帽变薄是导致斑块不稳定和斑块破裂的重要原因，其中纤维帽中血管平滑肌细胞的活性和数量是维持纤维帽厚度和斑块稳定性的关键因素，血管平滑肌细胞衰老是导致斑块破裂的重要机制[2]。衰老血管平滑肌细胞的增殖抑制、凋亡敏感性增加等特性导致修复破裂斑块的能力减弱，同时衰老细胞可促进炎性因子白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-6(IL-6)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等表达增加，产生促炎症环境而进一步诱导炎症细胞迁移,加速动脉粥样硬化进展，抑制斑块修复[3]，因此抑制血管平滑肌细胞衰老有助于维持易损斑块的稳定性。活血胶囊由黄芪、红花、赤芍、川芎等12味中药组成，具有补气养血、活血化瘀、理气安神等功效。既往动物实验表明，活血胶囊可缩小动脉粥样硬化斑块面积, 减少斑块内巨噬细胞浸润和炎性因子表达，具有抗炎和增强斑块稳定性的作用[4-5]。课题组前期研究显示，黄芪、红花、赤芍中多种单体成分可抑制炎性反应，同时还具有不同程度的抗氧化作用[6-8]。但活血胶囊对血管平滑肌细胞衰老是否有影响尚不明确。故本研究利用H2O2诱导离体培养的小鼠主动脉平滑肌细胞(mouse aortic smooth muscle cells，mASMC)发生衰老，研究活血胶囊对mASMC的抗衰老作用，以期为其药理学作用提供直接的实验室证据，为抗动脉粥样硬化中药复方和活性成分的研究提供新思路。

1 实验材料与方法

1.1材料 mASMC购自上海诺晨生物技术有限公司。活血胶囊购自西安大唐制药集团有限公司。H2O2购自西安依科生物技术公司。细胞培养基和胎牛血清购自Clontech公司，胰蛋白酶和双抗(青霉素和链霉素)购自上海碧云天生物技术研究所。总RNA提取试剂盒、反转录及荧光RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、β-半乳糖苷酶染色试剂盒和细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司，鼠ICAM-1、IL-8和IL-6酶联免疫吸附试剂盒均购自达科为生物技术股份有限公司。CO2细胞培养箱(美国Napco公司)，Model 680型酶标分析仪(美国Bio-Rad公司)，倒置光学显微镜(日本Olympus公司)，流式细胞仪(美国BD公司)，荧光PCR扩增仪(美国ABI公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 取mASMC，加入含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养液，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。0.25%胰蛋白酶消化传代，取4代以内细胞用于实验。

1.2.2药物溶液配制和细胞处理 称取0.9 g活血胶囊颗粒，充分研磨，加入6 mL无血清培养基37 ℃水浴充分溶解，2 000 r/min离心5 min，吸取溶液层，0.22 m微孔滤膜过滤分装，-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3细胞活力检测 实验分为对照组、活血胶囊150 μg/mL组、活血胶囊300 μg/mL组、活血胶囊750 μg/mL 组。将mASMC以1×104个/孔的密度接种于96孔细胞板中，对照组常规培养，其余各组加入相应浓度活血胶囊溶液，培养细胞24 h后，采用WST-1 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，于1.5 h在酶标仪上读取450 nm 处的吸光度值，计算各组细胞活力。相对细胞活力(实验组)=[OD(实验组)/OD(对照组)]×100%。

1.2.4细胞衰老SA-β-gal染色观察 先进行预实验，分别以100，200，300 μmol/L H2O2诱导培养mASMC 3 h，之后换为正常培养液，次日在显微镜下观察细胞，结果200 μmol/L H2O2和300 μmol/L H2O2诱导后细胞存在明显皱缩、脱落情况，100 μmol/L H2O2诱导后细胞变化较轻，所以后续以100 μmol/L H2O2诱导细胞衰老。正式实验分为3组：将mASMC接种于6孔板，对照组常规培养；H2O2组次日加入100 μmol/L H2O2诱导3 h，然后换成正常培养基恢复细胞状态24 h；活血胶囊+H2O2组次日加入750μg/mL活血胶囊处理细胞24h后，加入100 μmol/LH2O2诱导细胞3 h，然后换成正常培养基恢复细胞状态24 h。各组细胞处理后，每孔细胞用预冷的PBS漂洗1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10 min，吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min，吸除PBS，每孔加入1 mL提前配置好的染色工作液，避二氧化碳条件下37 ℃染色过夜。倒置显微镜下观察，蓝色细胞为阳性细胞，计算阳性细胞占细胞数目的百分比。

1.2.5衰老相关基因及衰老相关分泌表型(SASP)因子表达检测 p21、ICAM-1、IL-6、IL-8 mRNA检测时分为对照组、H2O2组、活血胶囊+H2O2组，沉默信息调节蛋白1(SIRT1)mRNA检测时分为对照组、活血胶囊24 h组、H2O25 h组和活血胶囊+H2O2组。采用实时定量RT-PCR法检测：各组细胞经相应培养处理后，加入适量TRIzol裂解细胞，收集裂解液，按照说明书提取总RNA。采用TaKaRa反转录试剂盒按照说明书以RNA为模板反转录出cDNA链；采用TaKaRa荧光定量PCR试剂盒按照说明书以cDNA为模板进行PCR反应。p21引物：上游为5’-AGATCTTCCGGAGCCAGG-3’，下游为5’-GGCGTCATCAAAGGAATGGT-3’；ICAM-1引物：上游为5’-ATGTGGGTGTTCAAGTTTCTGC-3’，下游为5’-CCACAAGATTCTGGGGACTC-3’；IL-6引物：上游为5’-CAGCTCCCTAGAAGATGGATTCAT-3’，下游为5’-GTCAGGAGTGGGAGCCATATG-3’；IL-8 引物：上游为5’-AGCCAGCCCCTGAAACTG-3’，下游为5’-CTGCCACTATCTTGCGGTTCT-3’； SIRT1引物：上游为5’-CTCAAGACGCCAGAATCCCA-3’，下游为5’-GGGTCCGGGAAAATGAAACC-3’；GAPDH引物：上游为5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游为5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3’。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 变性20 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，在延伸阶段进行荧光信号采集，40个循环。以GAPDH为内参基因，用公式2-ΔΔCt计算目的基因表达量。

1.2.6细胞上清液中炎症因子水平检测 实验分为对照组、H2O2组、活血胶囊+H2O2组，培养方法同1.2.4。收集各组细胞培养液，转移到离心管中，4 ℃下1 200 r/min 离心20 min，除去细胞杂质及碎片，留取上清液。采用ELISA试剂盒检测上清液中ICAM-1、IL-8、IL-6水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，最终在酶标仪上测450 nm波长处的吸光度值。

1.2.7细胞周期检测 实验分为对照组、H2O2组、活血胶囊+H2O2组，培养方法同1.2.4。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶收集细胞，PBS洗涤，加入1 mL预冷70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4 ℃固定2 h以上。1 000×g离心5 min沉淀细胞，将细胞重悬于1 mL PBS中，离心，沉淀细胞，每管细胞样品中加入500 μL配置好的碘化丙啶染色液，缓慢充分混匀，37 ℃避光温浴30 min 后，上流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

2 结 果

2.1各组细胞活力比较 细胞培养24 h后，对照组细胞活力为(61.05±0.03)%，活血胶囊150 μg/mL组、活血胶囊300 μg/mL组、活血胶囊750 μg/mL组细胞活力分别为(65.62±0.04)%、(66.07±0.10)%、(71.3±1.35)%，活血胶囊150 μg/mL组、活血胶囊 300 μg/mL组与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，活血胶囊 750 μg/mL组明显高于对照组(P<0.05)，故后续实验选用活血胶囊750 μg/mL浓度进行研究。

2.2各组细胞衰老情况 SA-β-gal染色显示，与对照组比较，H2O2组衰老细胞明显增多，表现为体积增大，多个核，SA-β-gal染色深；活血胶囊+H2O2组衰老细胞明显较H2O2组少。见图1。

图1 各组小鼠主动脉平滑肌细胞衰老SA-β-gal染色表现(×100)

2.3各组细胞衰老相关基因及SASP相关因子表达情况 H2O2组p21、ICAM-1、IL-8、IL-6 mRNA相对表达量均明显高于对照组(P均<0.05)；活血胶囊+H2O2组p21、ICAM-1、IL-6 mRNA相对表达量均明显低于H2O2组(P均<0.05)，IL-8 mRNA相对表达量与H2O2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。H2O25 h组SIRT1 mRNA相对表达量明显低于对照组(P<0.05)，活血胶囊24 h组SIRT 1 mRNA相对表达量明显高于对照组(P<0.05),活血胶囊+H2O2组SIRT1 mRNA相对表达量明显低于对照组但明显高于H2O25 h组(P均<0.05)。见图2。

图2 各组小鼠主动脉平滑肌细胞中p21、ICAM-1、IL-8、IL-6 及SIRT1 mRNA表达情况

2.4各组细胞培养上清液中炎症因子水平比较H2O2组细胞上清液中ICAM-1、IL-8、IL-6水平均明显高于对照组(P均<0.05)；活血胶囊+H2O2组ICAM-1、IL-6水平均明显低于H2O2组(P均<0.05)，IL-8水平与H2O2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.5各组细胞周期比较 H2O2组细胞周期停滞在

表1 各组小鼠主动脉平滑肌细胞中ICAM-1、IL-8、IL-6水平比较

G1期，G1期细胞比例为77.87%，明显高于对照组的69.39%(P<0.05)；S期细胞比例为12.48%，明显低于对照组的24.65%。活血胶囊+H2O2组G1期细胞比例为55.31%，明显低于H2O2组(P<0.05)；S期细胞比例为21.53%，明显高于H2O2组(P<0.05)。见图3。

图3 各组小鼠主动脉平滑肌细胞流式细胞术检测细胞周期情况

3 讨 论

细胞衰老最初描述的是正常细胞体外培养时在数次连续传代后进入不可逆的生长停滞状态，也称为复制衰老。衰老细胞具有增殖减慢、凋亡，S期细胞减少和G1期细胞比例增加，SA-β-Gal 活性上调，衰老相关标志物p16INK4a和p53/p21蛋白表达升高以及SASP等特征[9]。许多内外源性刺激因素也能够诱导细胞衰老，称为应激诱导早衰。研究认为，细胞衰老有可能成为某些老年性疾病的治疗靶点[10]。许多药物如白藜芦醇[11]和人参皂苷Rb1[12]对冠状动脉粥样硬化的治疗作用均与抑制斑块中细胞衰老相关。

既往研究显示，活血胶囊及其所含活性单体均具有抑制血管内皮细胞中TNF- α介导的黏附分子和IL-6表达的作用[13-15]。活血胶囊中的有效活性成分黄芪甲苷、羟基红花黄色素A和芍药苷能够通过降低细胞内胆固醇含量，抑制血管平滑肌细胞泡沫化，进而发挥抗动脉粥样硬化作用；还可激活bEND.3中PI3K/AKT/Nrf2信号通路，从而激活下游分子HO-1的表达，发挥抗氧化作用，抑制内皮功能失调和动脉粥样硬化进程[16-17]。上述研究表明活血胶囊可作用于斑块内多种细胞，影响多种信号通路，减少炎性因子和黏附因子分泌，改善斑块内炎性环境，增强斑块稳定性，从而抑制动脉粥样硬化的进程。本实验对活血胶囊是否可抑制H2O2诱导的mASMC衰老进行研究，发现H2O2可诱导mASMC衰老及SASP表型的表达和分泌，活血胶囊可显著抑制H2O2对mASMC中衰老相关β-半乳糖苷酶的诱导作用，可抑制H2O2诱导的ICAM-1、IL-6升高，说明活血胶囊可抑制H2O2诱导的mASMC衰老。

沉默信息调节因子(Sirtuins)是近年来发现的一类具有脱乙酰酶或ADP-核糖基转移酶活性的蛋白质，是一组NAD+依赖的、高度保守的组蛋白去乙酰化酶，可通过去乙酰化作用调节众多底物蛋白质的表达，哺乳动物Sirtuins可与p53、FOXO、PGC-1α、NF-κB、Ku70等蛋白相互作用，调控细胞应激反应、代谢、衰老和凋亡等过程[18]。SIRT1是Sirtuins家族中研究最多的亚型之一，其是能量代谢的调节因子[18]。修成奎等[19]报道，人参-三七-川芎提取物可能通过SIRT1-自噬通路延缓血管内皮细胞的衰老。周毅等[20]报道，SIRT1可通过上调血管平滑肌细胞中LXRα和ABCA1的表达,抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞泡沫化，从而影响动脉粥样硬化的进程。李书国等[21]研究表明，SIRT1能够减少血管紧张素Ⅱ诱导下血管平滑肌细胞中p21、p53蛋白表达,降低G0/G1期细胞比例。p21和p53是细胞衰老的标志蛋白，p21可以抑制细胞周期蛋白E活性，其是p53的下游靶基因，细胞内p53表达下调可以抑制p21的表达。本实验结果显示，H2O2诱导mASMC细胞后，细胞中p21 mRNA表达量升高，SIRT1 mRNA表达量降低，G0/G1期细胞比例升高；加入活血胶囊预处理后，细胞中p21 mRNA表达量降低，SIRT1 mRNA表达量升高，G0/G1期细胞比例降低。提示活血胶囊可能是通过SIRT1的作用，下调p21 mRNA表达，从而减轻H2O2对mASMC细胞周期的阻滞作用。

综上所述，活血胶囊可抑制H2O2诱导的mASMC衰老，机制可能与促进细胞中SIRT1表达、抑制ICAM-1和IL-6表达有关。该药的作用机制还有待深入研究，以为阐明活血化瘀中药抑制血管衰老、增强冠状动脉粥样硬化斑块稳定性的作用提供更多证据和理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。