基于网络药理学和分子对接探究威灵仙治疗类风湿性关节炎的作用机制

蒋叶坷，陈燕，潘凌宇，韩燕全，何宁，汪永忠*

(1.安徽中医药大学第一附属医院 国家中医药管理局中药制剂三级实验室 中药复方安徽省重点实验室 现代药物制剂安徽省工程技术中心，安徽 合肥230031. 2.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节损伤、持续性滑膜炎为主要表现特征的慢性炎症性疾病，其发病机制尚不完全清楚[1]，慢性炎症形成侵袭性血管翳和滑膜组织肿瘤样增生是类风湿性关节炎的重要特征之一[2]。据估计，全球类风湿性关节炎的平均患病率在0.5%～1.0%之间[3]。目前临床治疗类风湿性关节炎的西药主要用于减轻症状，长期使用会产生不良反应，包括呕吐、皮疹、白细胞减少和肝肾损伤[4]。因此，迫切需要找到高效低毒的药物来改善类风湿性关节炎的治疗和长期预后。类风湿性关节炎属于中医“痹证”范畴，其中，风寒湿邪，经络不畅、痰瘀互结是导致类风湿关节炎发生、发展的病机关键。故类风湿性关节炎的临床治疗亦遵循祛风除湿、散寒通络、扶正祛邪、祛痰化瘀、清热利湿、活血通络的治则[5]。中药防治疾病具有多靶点、多通路的整体调理的治疗原则，使其临床疗效显著。

威灵仙具有祛风湿、消痰涎、通经络、解散癖积之作用，被广泛应用于关节炎、腰膝疼痛、肢体麻木等疾病。威灵仙中主要含有皂苷、黄酮、木脂素、酚类、生物碱、挥发油等化学成分[6]。相关文献报道，威灵仙皂苷类成分是治疗类风湿性关节炎的主要成分，Xiong等[7]研究发现威灵仙三萜皂苷类化合物灵仙新苷(clematichinenoside AR)可能通过抑制p38和ERK MAPKS信号通路来降低TNF-α刺激的人成纤维样滑膜细胞MH7A中IL-6和IL-8的分泌。柳清等[8]采用气相色谱-飞行时间质谱技术检测威灵仙总皂苷(TSC)对AA大鼠血清代谢谱的变化，发现TSC对AA大鼠的治疗作用可能与调节脂代谢、氨基酸代谢和能量代谢有关。目前关于威灵仙治疗类风湿性关节炎的研究主要集中于相关化学成分的抗类风湿性关节炎作用，有关药效机制的研究相对较少。因此，应该进行更深入的机制研究。因网络药理学研究具有的整体性、系统性特点与现代中医药对于疾病治疗的整体观、辩证理论相适应和契合[9]，本研究采用网络药理学的方法来研究威灵仙治疗类风湿性关节炎的机制，为威灵仙的后期研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 软件与数据库

所用在线数据库及其网址见表1，Cytoscape3.7.1为网络分析软件， AutoDock Vina 1.5.6为分子对接软件，PyMOL软件将分子对接结果进行可视化。

表1 网络药理学研究数据库

1.2 威灵仙活性成分与作用靶点的筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine Systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)数据库中，以“威灵仙”为检索词，设置口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、类药性(drug-like index, DL)≥0.18，获取威灵仙的活性成分，补充《中国药典》中未能符合筛选标准但含量高的活性成分齐墩果酸。使用PubChem、SwissTargetPrediction数据库预测威灵仙活性成分的作用靶点。

1.3 类风湿性关节炎相关靶点的获取

在GeneCards、OMIM数据库中检索“rheumatoid arthritis”筛选得到与类风湿性关节炎相关的靶点。在GeneCards数据库中，Relevance score值越大，则代表该靶点与疾病联系越密切，若靶点过多，参考相关文献[10]，选择Relevance score大于中位数的靶点为类风湿性关节炎的潜在靶点。将两个数据库的靶点合并、删除重复值得到类风湿性关节炎的潜在靶点。

1.4 获取交集靶点并构建活性成分-交集靶点网络图

用在线画图工具Venny2.1.0构建维恩图，确定威灵仙活性成分与疾病的交集靶点。用Cytoscape3.7.1软件构建活性成分-交集靶点网络图，根据“度值(degree)大于均值筛选威灵仙治疗类风湿性关节炎的关键活性成分。

1.5 PPI网络的构建及核心靶点筛选

将交集靶点导入STRING数据库，设置交互分数>0.400，物种为“Homo sapiens”，获得蛋白质-蛋白质相互作用(proteinprotein interaction,PPI)网络图。将结果导入Cytoscape3.7.1软件进行“Network Analyzer”分析，筛选度值、介数(betweenness centrality)均大于平均值的节点为威灵仙治疗类风湿性关节炎的核心靶点[11]。

1.6 GO分析与KEGG通路分析

将获取的交集靶点输入到DAVID数据库，设置标识符为“OFFICIAL GENE SYMBOL”、物种选择为“Homo sapiens”，其余保持默认，进行基因本体(gene ontology，GO)功能分析与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。可视化P<0.05的通路，利用微生信平台绘制GO功能富集和KEGG通路富集图。

1.7 活性成分-靶点-通路网络的构建

将1.4项得到的交集靶点与相应活性成分，结合1.6项下得到的KEGG通路富集分析结果，通过Cytoscape3.7.1构建活性成分-靶点-通路网络图。

1.8 分子对接验证

在ZINC数据库中获取关键活性成分的3D分子结构mol2文件，PDB数据库下载核心靶点蛋白结构的PDB Format格式文件。采用AutoDock Tools软件对核心靶点蛋白结构进行去水、加氢、并计算其电荷，最后转换为pdbqt受体格式，将小分子加全氢、检测扭转键，转换为pdbqt配体格式。AutoDock Vina1.5.6软件进行分子对接，PyMOL软件对分子对接结果进行可视化。

2 结果与讨论

2.1 威灵仙主要活性成分及靶点筛选结果

在TCMSP数据库中根据设置的条件初步筛选出7个成分，去除1个未找到靶点的成分，根据《中国药典》补充不满足筛选条件但含量较高的成分齐墩果酸，最终确定7个成分，结果见表2。利用Swiss Target Prediction 数据库收集Probability大于0的靶点，共收集到251个靶点，删除重复值后得到104个靶点。

表2 威灵仙的活性成分

2.2 类风湿性关节炎靶点的预测结果

通过查询GeneCards与OMIM数据库，将数据经过筛选、删除重复值后共得到1 592个类风湿性关节炎的靶点。

2.3 获取交集靶点并构建威灵仙活性成分-交集靶点网络图

将威灵仙的104个活性成分作用靶点与1 592个类风湿性关节炎的靶点导入Venny2.1.0作图平台，获得威灵仙作用于类风湿性关节炎的靶点37个，见图1。使用Cytoscape3.7.1软件构建威灵仙活性成分-交集靶点网络图，该网络包含46个节点(7个威灵仙活性成分节点，37个交集靶点节点，1个威灵仙节点和1个类风湿性关节炎节点)，104条边，见OSID科学数据与内容附图1，使用网络拓扑学分析得到威灵仙治疗类风湿性关节炎的关键活性成分为齐墩果酸、3-表齐墩果酸、豆甾醇、β-谷甾醇。

图1 威灵仙治疗类风湿性关节炎潜在作用靶点Fig.1 The potential targets of Clematidis Radix Rhizoma in the treatment of rheumatoid arthritis

2.4 PPI网络分析及核心靶点的筛选

将交集靶点导入STRING数据库，构建PPI网络，Cytoscape3.7.1软件进行网络拓扑学分析及可视化展示，见OSID科学数据与内容附图2。网络中共有36个节点，122条边，各节点的平均度值为6.75，平均介数为0.034，节点的大小与颜色表示度值的大小，节点越大、颜色越深、度值越大的靶点为威灵仙治疗类风湿性关节炎的重要靶点。推测MAPK3、PTGS2、CYP19A1、PPARG、NR3C1、ALOX5靶点可能是威灵仙治疗类风湿性关节炎的核心靶点，见OSID科学数据与内容附图3。

2.5 GO和KEGG富集分析

利用DAVID数据库对威灵仙活性成分与类风湿性关节炎交集靶点进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。结果得到GO条目145条，包括生物过程(biological process , BP)94条，主要与转录起始RNA聚合酶Ⅱ启动子,类固醇激素介导的信号通路,对脂多糖、炎症反应的负调控,氧化还原过程,炎症反应,环氧合酶途径,脂氧合酶途径,前列腺素生物合成的过程等功能有关；细胞组成(cell component , CC)得到12条，主要与内质网膜、内质网、蛋白质复合体、细胞内的膜结合细胞器、细胞核、核浆、细胞器膜、核膜、核膜内腔、质膜等有关；分子功能(molecular function , MF)得到39条，主要与类固醇激素受体活性、类固醇结合、酶结合、RNA聚合酶II转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA结合、血红素结合、非跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶活性、锌离子结合、转录因子活性，序列特异性DNA结合、转录激活子活性，RNA聚合酶II核心启动子近端区域序列特异性结合等功能有关，将P< 0.05且排名前10的BP、CC、MF通过微生信平台作图，结果见OSID科学数据与内容附图4。

KEGG通路分析获得22条信号通路，主要涵盖了花生四烯酸代谢通路、卵巢类固醇生成、催乳素信号通路、甾体类激素生物合成、含血清素的神经突触、利什曼病、炎症介质对TRP通道的调节、雌激素信号通路、神经活性受体-配体相互作用、癌症通路等，利用微生信平台将P<0.05的前10条通路作气泡图，见OSID科学数据与内容附图5所示。

2.6 活性成分-靶点-通路网络图的构建

运用Cytoscape3.7.1软件将P值排名前10的通路与活性成分、交集靶点构建活性成分-靶点-通路图，见OSID科学数据与内容附图6。

2.7 分子对接验证

为明确核心靶蛋白与相应的活性成分之间的结合活性，以关键活性成分齐墩果酸、3-表齐墩果酸、β-谷甾醇、豆甾醇作为配体，核心靶点MAPK3、PTGS2、CYP19A1、PPARG、NR3C1、ALOX5作为受体，AutoDock Vina1.5.6软件进行分子对接，结果见表3。结合能评判小分子与蛋白的相互作用强度，结合能越低，表明两者结合越稳定，小分子与蛋白的最低结合能≤-5.0 kJ/mol[12]，说明药物成分与靶点具有强结合力。分子对接结果发现关键活性成分与核心靶点的结合能均≤-5.0 kJ/mol，说明威灵仙对类风湿性关节炎具有治疗效果。齐墩果酸与3-表齐墩果酸是度值排名前两位的关键成分，MAPK3与PTGS2是筛选出的排名前两位的核心靶点，因此认为齐墩果酸与3-表齐墩果酸作用于MAPK3、PTGS2是威灵仙治疗类风湿性关节炎的关键，对接结果显示其具有较好的结合活性，初步验证了网络药理学挖掘的结果，Pymol软件将对接结果进行可视化，见图2。

表3 关键活性成分与核心靶点的对接结果

表3(续)

注：ARG代表精氨酸；GLY代表甘氨酸；SER代表丝氨酸；LEU代表亮氨酸。图2 威灵仙治疗类风湿性关节炎的关键活性成分与核心靶点对接图Fig.2 Docking diagram of key active ingredients and core targets of Clematidis Radix Rhizoma in the treatment of rheumatoid arthritis

3 讨论

本研究采用网络药理学分析了威灵仙治疗类风湿性关节炎的物质基础和可能的分子机制，通过GO和KEGG富集分析得到威灵仙治疗类风湿性关节炎相关的分子功能、生物过程、作用通路。通过构建网络图和拓扑分析筛选得到齐墩果酸、3-表齐墩果酸、豆甾醇、β-谷甾醇关键活性成分，其核心靶点为MAPK3、PTGS2、CYP19A1、PPARG、NR3C1、ALOX5。分子对接初步验证了结果，说明威灵仙可能通过作用于以上的靶点和通路发挥治疗类风湿性关节炎的作用。

分析结果表明，威灵仙治疗类风湿性关节炎的关键成分为齐墩果酸、3-表齐墩果酸、豆甾醇、β-谷甾醇。成纤维样滑膜细胞(FLS)增殖和炎症因子分泌是类风湿性关节炎的主要病理特征，研究发现齐墩果酸及其衍生物具有显著的抗炎镇痛作用，齐墩果酸可能通过抑制TNF-α诱导的FLS细胞炎症因子的分泌来发挥治疗类风湿性关节炎的作用[13]，其衍生物能减轻类风湿性关节炎大鼠关节炎症[14]。豆甾醇能明显降低LPS诱导的环氧合酶-2(COX-2)的蛋白和mRNA表达水平，减少前列腺素E2(PGE2)的释放，发挥抗炎作用[15]。β-谷甾醇固体脂质纳米粒通过抑制NF-kB和激活HO1/Nrf-2通路发挥抗关节炎的作用[16]。提示上述成分可能是威灵仙治疗类风湿性关节炎的主要药效物质基础。

通过PPI分析并构建相关网络，筛选得到MAPK3、PTGS2、CYP19A1、PPARG、ALOX5、NR3C1 6个核心蛋白。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)信号通路包括ERK1/2、JNK1/2/3、p38-MAPK和ERK5。MAPK参与调节细胞分化、增殖、迁移、凋亡[17]，MAPKs已被证实在类风湿性关节炎的发病机制中发挥重要作用，激活MAPKs可导致促炎细胞因子的产生和关节炎症。研究发现类风湿关节炎患者滑膜组织中MAPKs的表达异常增加，促进滑膜增殖。因此，MAPK被认为是治疗类风湿性关节炎的有前途的潜在治疗靶点[18]。

前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)又称环氧化酶(COX)，有PTGS1和PTGS2两种亚型，环氧化酶是前列腺素生物合成中必不可少的限速酶[19]，在正常生理条件下，PTGS2低水平表达。然而，在炎症部位促炎因子的诱导下，PTGS2可以从单核细胞、滑膜细胞、内皮细胞等多种细胞中大量释放，参与炎症过程，造成机体损伤[20]。CYP19A1是细胞色素P450超家族的成员，他们是催化类固醇生成中许多反应的单加氧酶，又称芳香酶。在RA患者的滑膜组织中，巨噬细胞参与了外周性激素代谢，这与p450芳香化酶(CYP19A1基因编码)的局部作用有关[21]。

花生四烯酸代谢通路是威灵仙治疗类风湿性关节炎的关键通路，同时也是炎症反应的重要通路，花生四烯酸(AA)是一种多不饱和-6脂肪酸，主要作为磷脂的组成部分存在。在炎症刺激下，AA可通过胞质磷脂酶A2(cPLA2)释放，并通过代谢产生类二十五烷家族[22-23]，前列腺素和白三烯是这个家族中的两个重要成员，参与稳态生物功能和炎症[24]

综上所述，本研究利用网络药理学的方法对威灵仙治疗类风湿性关节炎的机制进行了初步的探索，结果表明威灵仙通过作用于多个靶点、多条通路发挥抗类风湿性关节炎的作用，为其进一步开发及临床应用提供了参考依据。