植物蛋白酶抑制剂的抗虫性研究进展

张 娜,刘志伟,刘德广

(西北农林科技大学植物保护学院,杨凌 712100)

长期以来,害虫防治主要依靠化学农药,这不仅能带来“3R”问题(即害虫抗药性、农药残留、害虫的再猖獗),还会造成严重的环境污染。寻找安全、高效、广谱性的抗虫基因来增强植物抗性成为害虫防治研究的重点,植物蛋白酶抑制剂是其中一个重要的研究方向。蛋白酶抑制剂(PIs)是一种广泛存在于植物组织中的小分子多肽或蛋白质,距今已有70多年的研究历史[1-3]。在昆虫消化道中,PIs能抑制消化蛋白酶的水解活性,从而对其生长发育产生负面影响[4]。PIs也能够进入害虫的血淋巴,干扰免疫系统,并降低卵母细胞的增殖能力[5]。本文综述了植物蛋白酶抑制剂的生理功能、昆虫的适应机制以及蛋白酶抑制剂在蚜虫防治方面的最新研究进展,并展望了蛋白酶抑制剂研究的未来发展趋势及在蚜虫防治方面的应用前景。

1 植物蛋白酶抑制剂生理功能

植物蛋白酶抑制剂在贮藏器官(如块茎和种子)、根、茎及叶片等组织中均有发现。蛋白酶抑制剂是植物体内的贮藏蛋白,也是内源性蛋白酶调节因子,参与种子萌发、种子休眠等生理过程。一般根据酶的活性位点及其氨基酸序列的同源性可将其分为4类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。目前研究比较深入的是丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂,因为很多鳞翅目、直翅目、双翅目和膜翅目昆虫的主要消化蛋白酶是丝氨酸蛋白酶,而许多鞘翅目昆虫的主要消化蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。一些研究表明,丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制剂也可抑制蚜虫的消化蛋白酶活性,且效果显著[6]。各种植物蛋白酶抑制剂的生理功能主要体现在生理调节、抵御环境胁迫、抗虫性等几个方面。

1.1 贮藏蛋白和调节因子

植物蛋白酶抑制剂是一种贮藏蛋白。在植物种子萌发过程中,其所含的蛋白酶抑制剂能被水解,从而为种子萌发和幼苗生长发育提供氮源和碳骨架[7]。另外,植物蛋白酶抑制剂也是一种活性调节因子。蛋白酶抑制剂具有蛋白酶的水解活性,能通过蛋白酶的水解作用来调控相关蛋白的降解[8]。如通过基因改造,水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(oryzacystatinⅠ,OCⅠ)基因在马铃薯块茎中成功表达后,能导致转基因马铃薯块茎内可溶性蛋白明显增加,而可溶性糖的含量显著降低,这反映了OCⅠ不仅能调控蛋白酶的水解作用,也能抑制淀粉酶活性[9]。此外,蛋白酶抑制剂也存在于植物体的其他组织内,调节各种蛋白酶的生理活性功能和蛋白代谢[10]。

1.2 抵御环境胁迫

植物体内包含多种蛋白酶抑制剂,能够在干旱、高温、盐及氧化胁迫等条件下被诱导表达,调控多种蛋白酶的代谢和生理活性,维持组织细胞渗透平衡,提高植物耐受性[11-17]。大量研究结合其防御非生物胁迫的基本原理,根据植物遗传转化的生物技术,利用启动子过表达相关蛋白酶抑制剂基因,增强了植物对非生物胁迫的耐受性。比如,Bowman-Birk型蛋白酶抑制剂在拟南芥中诱导表达,提高了拟南芥的抗旱性[11];板栗半胱氨酸蛋白酶抑制剂被高温和盐胁迫诱导表达,提高了植物对不良环境的耐受性[12]。Kunitz型蛋白酶抑制剂在芸薹属植物中诱导表达,响应高温和干旱胁迫[13]。对于植物自身而言,非生物胁迫不仅能够直接导致渗透压失衡的损害,也能够引起一系列氧化应激反应,蛋白酶抑制剂通过调控多种蛋白酶的代谢,也可调节氧化应激反应[16-17]。

1.3 抗虫性

不少研究表明,植物蛋白酶抑制剂能抑制各类昆虫消化蛋白酶的水解,扰乱昆虫正常的生长发育,表现出明显的抗虫性[18-40]。从表1可以看出,各蛋白酶抑制剂的效果因不同昆虫(如鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目等)体内主要消化蛋白酶种类不同而不同。如丝氨酸蛋白酶抑制剂能调节丝氨酸蛋白酶活性,调节双翅目昆虫的生长发育[18-19],影响鳞翅目昆虫幼虫体重和发育历期及成虫发育历期、繁殖力、存活率等[20-21]。而半胱氨酸蛋白酶抑制剂通过水解半胱氨酸蛋白酶,影响鞘翅目昆虫的正常生长发育[28]。多数鳞翅目昆虫的主要消化蛋白酶是丝氨酸蛋白酶,而多数鞘翅目昆虫的主要消化蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。因此,半胱氨酸蛋白酶抑制剂对鞘翅目昆虫的抗虫效果一般优于丝氨酸蛋白酶抑制剂。非寄主植物的蛋白酶抑制剂对植食性昆虫也具有显著抗虫性[29-30]。丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂均能够减轻蚜虫体重,延长若蚜发育历期,降低种群密度[36]。因此,蛋白酶抑制剂在蚜虫等刺吸式昆虫的防治中也具有一定的潜力。

表1 植物蛋白酶抑制剂的具体抗虫功能Table 1 Specific functions of plant protease inhibitors against insects

昆虫行为也会影响植物蛋白酶抑制剂基因的表达,从而影响植物的抗虫水平[36,41-44]。例如,甜菜夜蛾Spodopteraexigua取食造成植物叶片损伤,可直接诱导蛋白酶抑制剂基因表达[36]。稻纵卷叶螟的取食能诱导拔节期至扬花期水稻叶片中胰蛋白酶抑制剂基因表达,但抑制其在乳熟期的表达[41-42]。二化螟Chilosuppressalis取食也能诱导水稻中胰蛋白酶抑制剂的高表达,从而使得水稻对该虫表现出诱导抗虫性[43];但随后褐飞虱Nilaparvatalugens取食能抑制胰蛋白酶抑制剂的表达,降低水稻对二化螟的抗性[44]。而且昆虫取食为害后能诱发植物的过敏反应,刺激植物体内产生病原相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PR),这些PR会进一步影响蛋白酶抑制剂介导的昆虫-植物之间的互作。

微观层面蛋白酶抑制剂的作用机制与昆虫蛋白酶的活性位点密切相关。蛋白酶抑制剂与昆虫蛋白酶的活性位点或变构位点结合,抑制其蛋白水解酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶。根据蛋白酶抑制剂与蛋白酶的结合位点,可将蛋白酶抑制剂分为3类[45]:1)双头抑制剂,具有两个不同的活性位点;2)多结构域抑制剂,如块茎休眠和防御相关的多聚体半胱氨酸蛋白酶抑制剂;3)多种蛋白酶抑制剂聚合体。蛋白酶抑制剂可通过与各种蛋白酶的结合调节蛋白酶的水解活性,影响昆虫体内重要的生理过程如叶酸合成(叶酸参与核酸物质的合成)[46]、减缓脂质代谢[47]、蜕皮过程[如下调保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE)、保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)和保幼激素二醇激酶(juvenile hormone diol kinase,JHDK)的基因表达][48]。

总的来看,PIs在昆虫-植物协同进化中能发挥重要作用,各种植物中都含有蛋白酶抑制剂,研究较多的是豆科(如豇豆等)、茄科(如烟草等)以及禾本科(如水稻等)植物的PIs[37-49],其他植物PIs的研究明显不足。现有研究虽然发现了很多植物PIs,但其效用都没有达到足以防治害虫的强度,需要开发效用更高的PIs。而且,一些最根本的问题仍然没有得到解决,如PIs在不同昆虫肠道上作用靶标的进化特点和演变规律的异同,再加上害虫能对植物PIs产生适应性,使得目前仍很难在生产上利用PIs防治害虫。

2 昆虫适应机制

植物蛋白酶抑制剂作为一种防御蛋白,能抑制各种昆虫蛋白酶的水解活性,干扰昆虫正常生长发育,但昆虫对其也会逐渐产生适应性。如饲喂丝氨酸蛋白酶抑制剂开始时能显著降低大豆夜蛾Anticarsiagemmatalis胰蛋白酶和总蛋白酶活性,但连续饲喂两周后,该虫体内总蛋白酶活性会有一定程度恢复甚至升高[25]。有研究基于密码子机制-经验组合(mechanistic-empirical combination,MEC)进化模型比较了鞘翅目四纹豆象Callosobruchusmaculatus、玉米根萤叶甲Diabroticavirgifera和马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata的25个中肠半胱氨酸蛋白酶基因的编码序列,对高度变异的氨基酸及结构位点进行了深入分析,发现对昆虫蛋白酶的正选择作用以及昆虫快速进化适应植物蛋白酶抑制剂的有力证据[50]。因此,在长时间进化过程中,昆虫能对蛋白酶抑制剂产生适应性,其适应方式包括调节消化道内环境pH、分泌蛋白酶、改变蛋白酶构象等。

2.1 昆虫适应机制的种类

2.1.1调节消化道内环境pH

蛋白酶抑制剂的稳定性是影响其水解作用的重要因子之一,作为一种蛋白质,其稳定性和活性与昆虫消化道内环境pH密切相关,有时仅在特定的pH条件下才具有活性。如Oppert在研究马铃薯羧肽酶抑制剂(carboxypeptidase inhibitor,CPI)对谷蠹Rhizoperthadominica蛋白酶的作用时发现,在酸性条件下,CPI对谷蠹失去杀虫活性[51]。一些昆虫的蛋白酶在特定的pH条件下才具有较好的活性,如双翅目昆虫的天冬氨酸蛋白酶适合较低的pH,鳞翅目昆虫的丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶适合高于10.5的pH,鞘翅目昆虫的半胱氨酸蛋白酶适合稍微偏酸的pH等[52]。昆虫可以根据消化道内变化的pH条件转换蛋白酶种类,借此应对植物蛋白酶抑制剂的负面作用[53]。

2.1.2分泌蛋白酶

2.1.2.1分泌敏感蛋白酶

首先,在基因转录过程中,昆虫可通过提高敏感蛋白酶基因的转录水平,提高敏感蛋白酶的表达量。其次,昆虫也可通过翻译后的修饰调节,分泌大量敏感蛋白酶。如四纹豆象消化道内存在半胱氨酸蛋白酶基因的两个亚型,分别是CmCPAs 和 CmCPBs;在蛋白酶抑制剂的诱导作用下,CmCPA1经自动切除前导肽,表达提升2.5倍,而CmCPB1经翻译后修饰,表达提升116倍[53]。因此,当蛋白酶抑制剂存在时,昆虫可通过调控敏感蛋白酶的基因表达,分泌大量敏感蛋白酶,借此适应蛋白酶抑制剂。

2.1.2.2分泌不敏感蛋白酶

分泌不敏感蛋白酶也是昆虫适应植物蛋白酶抑制剂的重要机制,如甘蓝银纹夜蛾Trichoplusiani能通过提高不敏感蛋白酶活性,适应大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂[54]。一方面,当蛋白酶抑制剂存在时,昆虫消化道内敏感蛋白酶可向不敏感蛋白酶转化。如大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂N(soyacystatin N,scN)能诱导四纹豆象消化道内蛋白酶由半胱氨酸蛋白酶为主向天冬氨酸蛋白酶为主转变[53]。另一方面,蛋白酶抑制剂可直接诱导不敏感蛋白酶基因表达。如马铃薯甲虫能通过基因表达的显著提升和不敏感蛋白酶的大量分泌来应对食物中的大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂[55]。

2.1.2.3分泌水解蛋白酶

大量研究表明,昆虫调节蛋白酶敏感性以适应植物蛋白酶抑制剂。但昆虫体内存在一类蛋白酶,能够水解植物蛋白酶抑制剂。例如,昆虫天冬氨酸蛋白酶可以降解植物蛋白酶抑制剂[53]。昆虫丝氨酸蛋白酶和亮氨酸氨肽酶结合蛋白可以降解植物蛋白酶抑制剂[56]。黑葡萄耳象Otiorynchussulcatus体内发现一种新型蛋白酶,可以水解水稻蛋白酶抑制剂[57]，类似的情况在四纹豆象中也有发现[55]。昆虫可将植物蛋白酶抑制剂转换为有利蛋白,提供营养物质。

2.1.3改变蛋白酶构象

昆虫可以改变蛋白酶构象,降低或阻断蛋白酶抑制剂的结合,来应对植物蛋白酶抑制剂。一方面,蛋白酶通过改变蛋白酶构象,形成多聚体,减少与蛋白酶抑制剂的接触面积[58]。另一方面,蛋白酶活性位点的构象也可以改变。如在蛋白酶抑制剂scN的作用下,四纹豆象消化道内敏感蛋白酶活性位点周围的构象会发生改变,从而改变相关蛋白酶对scN的敏感性[53]。

2.2 昆虫适应性相关研究的不足之处和展望

为了满足营养需求,植食性昆虫能通过调整消化道结构、酶分泌和消化过程来适应寄主蛋白酶抑制剂。由于植物养分组成的原因,氮成为许多植食性昆虫营养摄取的限制因素,蛋白酶的消化和代谢是氮营养摄入的关键一环,因为昆虫摄入的蛋白质都是大分子形式,这些大分子在被利用之前须先被蛋白酶水解变成小分子。由于植食性昆虫消化蛋白酶的多样性,昆虫能通过分泌大量敏感蛋白酶、不敏感蛋白酶和水解蛋白酶等快速适应寄主植物PIs,从而补偿生长所需要的养分不足。相关研究都集中在害虫取食PIs后不同蛋白酶的分泌量的变化,很少涉及一些重要问题,如昆虫如何识别食物中的PIs?昆虫防御PIs涉及的关键基因有哪些？相关机制是什么？昆虫防御PIs所涉及的调控元件是什么？最近的研究表明,蛋白酶抑制剂N端和C端的延伸肽在植物防御反应中能发挥重要作用[49],这提供了一个新的领域和研究方向,可借此探索昆虫蛋白酶分泌的调控机制。上述这些问题的深入研究将有助于发展延缓昆虫适应PIs的手段,促进基于植物PIs的害虫绿色防治。

3 植物蛋白酶抑制剂在蚜虫防治中的应用潜力

蚜虫是世界上重要的农业害虫,由于其生活史短,孤雌生殖等特点,能够在短时间内大量繁殖。蚜虫刺吸植物韧皮部汁液,需要将多余的糖分以蜜露的形式排出体外,覆盖在植物叶片表面,容易导致‘煤烟病’。蚜虫也是植物病毒的媒介昆虫,传播200多种病毒,对农作物造成严重危害[59-60]。长期以来,蚜虫的防治主要依靠使用化学农药,但蚜虫可快速进化为抗性种群,农药的大量和频繁使用,会严重污染环境和损害人体健康,急需开发新型生物杀蚜剂[61]。

蛋白酶抑制剂是普遍存在于植物体内的防御蛋白,能够不可逆结合昆虫消化蛋白酶。寄主蛋白酶抑制剂通过抑制昆虫的消化作用,导致虫体内游离氨基酸短缺,从而对其生长发育产生不利影响;即使随后补充游离氨基酸后,也不能使昆虫恢复正常的生长发育[49]。因此,蛋白酶抑制剂除抑制昆虫消化作用外,还可能参与其他生理过程。蚜虫是一种刺吸式口器昆虫,通过内共生菌获取游离氨基酸,不依赖于消化蛋白酶,但蛋白酶抑制剂对蚜虫生长发育也具有消极影响。用含大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Hordeumvulgarecysteine protease inhibitor 6,HvCPI-6) 的人工饲料饲喂豌豆蚜Acyrthosiphonpisum,可有效抑制其消化蛋白酶活性,延长其若虫发育历期[62]。转基因试验结果显示,水稻丝氨酸蛋白酶抑制剂CI2c基因的过表达能抑制禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi的繁殖[25]。丝氨酸蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂均能够减轻蚜虫体重,延长若蚜发育历期,减少害蚜种群密度[25,36]。而且,植物蛋白酶抑制剂会通过影响蚜虫的初级共生菌Buchneraaphidicola来抑制宿主繁殖力[5]。因此,蛋白酶抑制剂在蚜虫防治中具有较为独特的优势和较好的潜力。

3.1 植物蛋白酶抑制剂的抗蚜性

蛋白酶抑制剂这类植物小分子防御蛋白,能够通过作用于蚜虫消化蛋白酶来扰乱蚜虫生长发育,如大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂(soybean bowman-birk inhibitor,SbBBI)能影响马铃薯长管蚜Macrosiphumeuphorbiae的生活史参数[36]。再如桃蚜取食半胱氨酸蛋白酶抑制剂HvCPI-6后,体重减轻,若虫发育历期延长[62]。但水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂能增强桃蚜总蛋白酶活性,原因在于桃蚜需要分泌大量不敏感消化蛋白酶,来维持正常生理代谢。可见,蚜虫需要在消化上消耗额外的大量能量来抵御食物中的蛋白酶抑制剂,从而影响其生长发育。

植物蛋白酶抑制剂还能通过影响蚜虫的免疫系统影响蚜虫的生长发育。如水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂能降低豌豆蚜组织蛋白酶B和L活性;再如大麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂HvCPI-6能与豌豆蚜组织蛋白酶相契合,抑制其组织蛋白酶活性[62]。因此,植物蛋白酶抑制剂会导致蚜虫对病原微生物的免疫能力下降,从而降低蚜虫对不良环境的适应能力。

植物蛋白酶抑制剂也会影响蚜虫的初级共生菌B.aphidicola。免疫荧光组织化学试验表明,植物蛋白酶抑制剂被蚜虫摄入体内,紧贴中肠上皮细胞,除在肠腔内有聚集外也能够到达血淋巴的含菌细胞[5]。蛋白酶抑制剂在含菌细胞内,抑制内共生菌B.aphidicola的正常代谢。内共生菌B.aphidicola对蚜虫至关重要,其受到负面影响会导致蚜虫自身的存活和繁殖受到严重影响。如水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂OC-Ⅰ和大麦蛋白酶抑制剂HvCPI-6都能降低桃蚜和豌豆蚜的繁殖力[62];水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂OCI也能降低马铃薯长管蚜种群的繁殖和增长[63]。

3.2 蛋白酶抑制剂对蚜虫等刺吸式口器害虫作用的独特性和应用潜力

刺吸式口器昆虫如蚜虫等取食的汁液中小分子自由氨基酸的含量远高于大分子蛋白的含量,因此蚜虫等刺吸式口器害虫无需对所摄入的大分子蛋白进行分解和代谢。但是,研究表明,植物PIs对蚜虫的食物代谢活动仍具有明显的负面作用,这种作用涉及的生理生化机制目前仍不清楚,但比较独特,完全不同于前文描述的鳞翅目幼虫、鞘翅目等咀嚼式口器昆虫涉及肠道消化蛋白酶的生理生化机制。如上所述,蛋白酶抑制剂虽然能在一定程度上抑制蚜虫消化作用,但也会影响其免疫系统以及与内共生菌相互作用等,哪种作用方式在其抗蚜性中占主导地位目前并不清楚,相关机制也不明确。鉴于植物PIs对蚜虫等刺吸式口器害虫作用的独特性,如深入研究并开发出专门针对这类害虫的绿色防治手段,将具有很好的应用前景。

3.3 筛选高效蛋白酶抑制剂

在植物-昆虫进化过程中,昆虫能形成多种适应机制,如过表达敏感蛋白酶或不敏感蛋白酶等来降低蛋白酶抑制剂的危害。因此,需要通过筛选高效、特异性蛋白酶抑制剂来提高害虫防治效果。如有研究通过抽提并纯化四棱豆Psophocarpustetragonolobus种子内蛋白酶抑制剂(winged bean trypsin inhibitors,WBTIs),来比较其对棉铃虫胰蛋白酶的抑制效率,成功筛选了WBTI-1,WBTI-2和WBTI-3等3种高抑制力蛋白酶抑制剂[64]。研究人员在研究非植物源蛋白酶抑制剂的抗蚜性时,发现伯氏致病杆菌Xenorhabdusbovienii蛋白酶抑制剂Xbpi-1对豌豆蚜的生长和存活有不利影响[61,65]:氨基肽酶对蚜虫的食物消化和生化活性起着重要的作用,当蚜虫摄入Xbpi-1后,豌豆蚜氨肽酶活性降低18.30%;总糖、糖原和脂质含量分别降低39.41%、24.61%和26.25%;游离氨基酸含量降低20.78%;碳水化合物、游离氨基酸和脂类等必需营养物质的降低不利于豌豆蚜的生长发育。因此,可通过拓宽蛋白酶抑制剂种类,增加筛选到高效蛋白酶抑制剂的机会。

随着分子生物学的快速发展,筛选特异性蛋白酶抑制剂最高效的方法并不是对多种多样的植物蛋白酶抑制剂都进行耗时费力的试验测试,现在可基于分子动力学的模拟来筛选高效的植物蛋白酶抑制剂。例如,有研究利用液相色谱法(liquid chromatography,LC)与串联质谱分析(tandem mass spectrometry,MS/MS)相结合来高效鉴定寄主或非寄主植物蛋白酶抑制剂,再通过光谱计数分析计算各蛋白酶抑制剂与马铃薯甲虫蛋白酶的结合能力,从而筛选与该虫特异性结合的蛋白酶抑制剂[66]。再如有研究首先用软件预测蛋白酶抑制剂(Anticarsiagemmatalistrypsin inhibitor,ApTI)、大豆夜蛾胰蛋白酶等的3D结构,然后通过同源建模、能量最小化分析等选择最优模板,确定目标蛋白酶抑制剂的三维结构;再将各种蛋白酶抑制剂与上述胰蛋白酶进行分子对接分析,根据几何结构和能量评估,确定匹配效果;最后采用分子动力学方法对各种蛋白酶抑制剂与胰蛋白酶的复合模型进行动态模拟,判断配合物的稳定性,通过最优结合模型筛选高效蛋白酶抑制剂[33]。

另外,还可以根据蛋白酶抑制剂基因具有高变异性和特异性特点,利用定点突变技术,发展高效新型蛋白酶抑制剂。例如,芥菜胰蛋白酶抑制剂(mustard trypsin inhibitor 2,MTI-2)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,能显著降低甜菜夜蛾幼虫的蛋白酶活性,但桃蚜对其不敏感;分析MTI-2与蛋白酶结合位点发现,该位点是由位于Arg-20和Ile-21之间的P1和周围残基介导的,选取氨基酸Ala-18到phe22 DNA编码区,用NNK密码子(N:A,C,G,T;k:G,T)取代该区域15个核苷酸;NNK密码子的随机化结果可产生大约3 400万个DNA序列,编码205万～320万个多肽;利用分子计算和定点突变技术成功筛选到10个MTI-2突变体,并利用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技术验证了突变体与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结合能力;最后利用人工饲料饲喂试验验证了突变体对害虫的作用[67-69]。

3.4 新技术、新策略

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是异源双链RNA阻碍特定基因的翻译或转录,导致靶标基因沉默或表达量明显下调的现象。昆虫中存在两种RNA干扰方式,包括细胞自主RNAi和非细胞自主RNAi。线虫体内非细胞自主RNAi信号传递的关键基因是SID-1,而棉蚜Aphisgossypii和麦长管蚜Sitobionmiscanthi中存在SID-1同源基因[66-67],这可能有利于非细胞自主RNAi在蚜虫中的发生。另一方面,蚜虫的中肠上皮细胞存在大量微绒毛,有利于吸附外源siRNA。因此,RNA干扰这种新技术在蚜虫上也具有较好的应用潜力,而且该技术可与植物转基因技术以及新型植物蛋白酶抑制剂结合起来使用。有研究将桃蚜丝氨酸蛋白酶(Myzuspersicaeserine protease,MySP)dsRNA基因转入拟南芥,转基因拟南芥体内会产生大量小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid,siRNAs),这些siRNAs被蚜虫摄入后能抑制其丝氨酸蛋白酶基因表达,显著降低了其蛋白酶活性[71]。因此,蚜虫蛋白酶的RNAi干扰其蛋白酶基因表达,而植物蛋白酶抑制剂也可直接抑制其蛋白酶的水解活性,两者结合起来使用,能提高对蚜虫生长发育的抑制效果。

另外,虽然并不是所有外来双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)均能够被植物吸收,且dsRNA容易在植物表面被降解,但喷洒人工合成dsRNA于植物表面防治害虫也具一定效果,特别是在使用时结合纳米新技术的情况下会有更好的效果。纳米颗粒是一种有效的转运载体,不仅运输外源物质到植物体内,而且提高了外源物质的稳定性[72]。如大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor,STI)与介孔二氧化硅纳米颗粒(mesoporous silica nanoparticles,MSNs)结合,喷洒于植物表面,提高了植物细胞摄取STI的速率。大豆胰蛋白酶抑制剂STI与二氧化硅纳米粒子(silica nanoparticles,SiNPs)相偶联,提高了STI稳定性和底物结合力,对胰蛋白酶的抑制效率高达80%[71]。该研究还发现棉铃虫Helicoverpaarmigera幼虫更倾向于选择游离STI处理过的叶片,而避开Si20APT-STI处理过的叶片,说明Si20APT-STI对害虫产生了驱避作用。因此,新型植物蛋白酶抑制剂与RNA干扰技术、纳米技术相结合,在害虫包括蚜虫的防治中具有极大的应用潜力。

4 展望

蛋白酶抑制剂是天然的小分子蛋白,广泛存在于植物组织内,具有防御各种植食性昆虫的功能,但目前防治效果有限,昆虫也逐渐形成了一系列的适应机制,而且PIs作用的广谱性会带来生物安全问题(如对天敌瓢虫的负面影响等)[73]。相关研究虽然很多,但一些基本问题仍需要更深入系统的研究,如昆虫识别食物中PIs的方式和策略、昆虫防御PIs涉及的关键基因和相关机制、昆虫防御PIs所涉及的调控元件、以及PIs对天敌昆虫的负面影响和生物安全等。上述这些问题的深入研究将有助于发展延缓昆虫适应PIs的手段,促进基于植物PIs的害虫绿色防治。将来为提高其防效可从如下几方面着手:1)利用现代生物学技术筛选更高效的PIs,或与RANi和基因编辑技术相结合提高其防效;2)通过基因叠加,在转基因作物中植入多个PI基因,或利用质粒工程技术大幅提高转基因作物的PI表达量;3)延缓害虫适应性的发展速度。植物PIs对蚜虫等刺吸式害虫也具有明显的负面作用,这种作用涉及的独特生理生化机制目前仍不清楚,这方面的深入研究可能开发出专门针对蚜虫等刺吸式害虫的绿色防治手段。随着分子生物学和组学技术的快速发展,快速筛选新型、高效蛋白酶抑制剂已成为可能,这些新型、高效PIs与转基因技术、纳米技术、RNA干扰等新技术的结合使用,将在包括蚜虫等刺吸式害虫在内的各种害虫的绿色防控中具有重要价值和广泛应用前景。