吩嗪类化合物对梨火疫病菌的抗菌活性研究

孙伟波,赵杨扬,明 亮,董靓靓,朱守卫,赵延存,刘凤权*

(1.江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地,南京 210014;2.安徽农业大学植物保护学院,合肥 230036;3.江苏省徐州市农业农村综合服务中心,徐州 221000)

我国是世界果树产业第一大国,果业在保障食物安全、生态安全、农民增收和农业可持续发展中发挥着日益重要的作用[1]。梨是我国种植范围最广的果树之一,是仅次于苹果、柑橘的第三大水果,我国梨的栽培面积和产量更占到了世界的近70%,梨产业的健康发展对我国乃至世界果业发展至关重要[2]。

梨火疫病(pear fire blight)是由解淀粉欧文氏菌Erwiniaamylovora引起的世界性重要植物细菌性病害,严重威胁梨等果树生产。该病害于1780年首次报道于美国纽约,现已分布于北美、欧洲、非洲、大洋洲的60多个国家和地区[3]。梨火疫病菌寄主范围广泛,可以侵染40余属200多种蔷薇科植物;可危害梨树的多个部位,从春季开始危害花朵,使花朵发黑萎蔫,出现“花腐”现象,扩展至嫩梢后出现褐色至黑色水渍状病斑,顶端弯曲下垂呈现“牧羊鞭”状,叶片果实均会萎蔫发黑但不掉落,叶柄、果柄等部位常出现褐色菌脓,严重时整株死亡;梨火疫病传播途径广泛,风雨气流、鸟类迁移、昆虫授粉以及人为活动等均可传播,给防治带来极大困难[3-5]。梨火疫病于2020年被我国列入《一类农作物病虫害名录》,其病原菌于2007年即被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》,是我国重要的农业植物检疫性有害生物。

药剂防治是梨火疫病的重要防治手段之一。化学农药的长期使用不仅危害生态环境健康,还会使病原菌产生耐药性,链霉素、土霉素等抗生素因此已被禁用[6-9]。国外开发了诸多针对梨火疫病的生物防治产品,如利用荧光假单胞菌PseudomonasfluorescensA506开发的“BlightBan A506”、利用泛菌Pantoeasp.开发的“BlightBan C9-1”、利用枯草芽胞杆菌BacillussubtilisQST713开发的“Serenade”等[9],均有一定规模的应用。在我国,截至2022年5月20日,登记防治梨火疫病的产品有12个,有效成分主要有中生菌素、春雷霉素、噻唑锌、噻霉酮等,还包括1个复配产品春雷·噻唑锌[10],药剂种类相对较少,长期使用也容易产生抗药性,因此需要不断开发新型防控药剂。

绿针假单胞菌PseudomonaschlororaphisTC3和抗生素溶杆菌LysobacterantibioticusOH13是本课题组分别从梨树和水稻根际环境中分离获得的生防细菌,前期对其次生代谢产物进行分离和鉴定,获得了多个吩嗪类化合物(图1),其中一些化合物表现显著的抗细菌活性[11-13]。为了明确吩嗪类化合物对梨火疫病菌的抗菌活性,本研究通过测定菌悬液OD600的方法,评价了5个吩嗪类化合物、部分登记的防治药剂及其复配药剂对梨火疫病菌的室内抗菌活性,以期为进一步扩充梨火疫病的防治药剂种类、开发利用吩嗪类化合物提供依据。

图1 吩嗪类化合物结构图Fig.1 Chemical structures of phenazine compounds

1 材料与方法

1.1 材料

LB培养基:胰蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,氯化钠10 g/L,121℃灭菌20 min冷却后备用。固体LB培养基需另加入琼脂17 g/L。

病原菌:梨火疫病菌Erwiniaamylovora菌株K21-16,由本实验室2021年分离自新疆库尔勒香梨枝条,保存于-80℃超低温冰箱。

供试药剂:药剂来源见表1。使用分析天平定量称取药剂,先用DMSO溶解并稀释,配制成不同浓度梯度的母液,后续取母液10 μL加入到1 mL LB培养基中,配成不同浓度的工作液,工作液浓度梯度见表1。

表1 供试药剂来源及工作液浓度梯度Table 1 Sources of agents and concentration gradients of working solutions

1.2 试验方法

1.2.1菌悬液制备

取保存于-80℃的梨火疫病菌菌株K21-16,在LB固体平板上划线,28℃黑暗条件培养2 d。挑取单菌落接种于3 mL LB液体培养基中,置于摇床上,28℃、180 r/min黑暗条件培养18 h,调节OD600=1.0制成菌悬液备用。

1.2.2单剂抗菌活性测定

参考相关标准和文献的方法并做适当修改[14-16]。具体如下:取无菌的24孔板,每孔加入1 mL LB液体培养基,按1%体积比(10 μL)加入上述菌悬液,再按1%的体积比(10 μL)加入供试药剂母液,使药剂浓度为表1中的设置浓度梯度。将24孔板用封口膜封好后置于摇床中,28℃、120 r/min条件下培养20 h,取出后测定每孔菌液的OD600。以不含药剂,只加10 μL DMSO溶剂作为对照组,按以下公式求得各药剂处理的抑制率。

抑制率=(对照组OD600—药剂处理组OD600)/对照组OD600×100%。

1.2.3复配药剂抗菌活性测定

根据单剂活性大小确定了以吩嗪-1-羧酸∶中生菌素、吩嗪-1-羧酸∶春雷霉素作为复配组合,该药剂组合不同质量配比和浓度梯度设置如表2。复配药剂组合抑制率的测定方法与1.2.2相同。

1.2.4增效系数测定

采用Wadley法计算复配组合的增效系数(SR)。公式X1=(Pa+Pb)/(Pa/a+Pb/b),其中X1为混剂EC50理论值,Pa、Pb分别为混剂中A、B的百分含量(%),a、b分别为混剂中A、B的EC50值。增效系数SR=X1/X2。X2为混剂EC50实测值。SR<0.5为拮抗作用,0.5≤SR≤1.5为相加作用,SR>1.5为增效作用。

表2 复配药剂配制比例和浓度梯度设置Table 2 Proportions of compound reagents and building up of concentration gradients

1.2.5数据处理

药剂抗菌活性所得数据采用DPS 7.05软件进行统计分析,以药剂浓度的对数值和抑制率的生物几率值进行回归分析,建立回归方程,求出抑制中浓度(EC50)、95%置信限等数据。

2 结果与分析

2.1 单剂抗菌活性

通过测定梨火疫病菌菌液在不同浓度药剂中的OD600,求出了梨火疫病菌对不同药剂的敏感基线和EC50,明确了不同单剂药剂对梨火疫病菌的抗菌活性,具体结果见表3。结果显示,不同供试药剂对梨火疫病菌的抗菌活性差异很大。四环素的抗菌活性最强,EC50仅为0.41 μg/mL,其次为噻霉酮和堆囊粘菌素,EC50分别为7.21 μg/mL和7.20 μg/mL。中生菌素和吩嗪-1-羧酸的EC50为10.75 μg/mL和46.41 μg/mL,春雷霉素和噻唑锌的EC50为50.74 μg/mL和72.15 μg/mL,这4种化合物的抗菌活性中等。另外3种吩嗪类化合物Compound 2、2-羟基-吩嗪-1-羧酸、2-羟基吩嗪抗菌活性较弱,EC50均在1 000 μg/mL以上。

2.2 复配药剂抗菌活性

通过单剂活性测定，筛选到了吩嗪-1-羧酸具有较好的抗菌活性，该化合物已实现商业生产。本研究将其与活性接近的中生菌素和春雷霉素进行了复配，以确定增效作用大小。复配药剂的测定结果见表4。结果显示，相对于单剂，吩嗪-1-羧酸与中生菌素复配有一定的相加作用，以吩嗪-1-羧酸∶中生菌素=9∶1作用较为明显，增效系数为1.28，其他配比的增效系数较低。吩嗪-1-羧酸与春雷菌素3个配比的增效系数均在1.0以下，显示两者有比较弱的相加作用。

表3 不同单剂药剂对梨火疫病菌的抗菌活性Table 3 Antagonistic activities of different single agents against Erwinia amylovora

续表4 Table 4(Continued)

3 结论与讨论

梨火疫病是我国及世界上重要的检疫性细菌病害,药剂防治仍是重要的防控措施之一,研究和开发新的高效防治药剂对于解决防治药剂种类少、降低抗药性风险等问题意义重大。吩嗪类化合物是一类由多种细菌产生的含多个氮原子的杂环化合物,有独特的光学性质和氧化还原特性,在化学、化工、物理等领域有多年的研究基础,在医药、农药、电池、导体、发光材料等领域也有广泛的应用价值[17]。

堆囊粘菌素(myxin)是抗生素溶杆菌LysobacterantibioticusOH13产生的一个吩嗪类次生代谢产物,作为兽医药和抗真菌药物已有多年的历史,在癌症治疗中也有一定的应用价值[18-19]。Compound 2是该菌株产生的另一个主要的吩嗪类化合物。myxin不稳定,可转化为稳定的Compound 2[12-13]。本研究测定了这两个化合物对梨火疫病菌的抗菌活性,显示myxin (EC50=7.20 μg/mL)的活性和噻霉酮相当,远高于Compound 2 (EC50=1 079.88 μg/mL)的活性,因此myxin在抑制梨火疫病菌方面有进一步的利用价值,这一结果和我们前期采用抑菌圈测定的结果是一致的[11]。因为myxin的化学结构与Compound 2的结构差别仅是5号位置的N被氧化形成N-O共轭电子基团(图1),所以这一基团对于化合物保持梨火疫病菌抗菌活性来说是必需的,未来可通过衍生化反应进行化合物的修饰改造,以保持myxin的活性并增强化合物的稳定性。

吩嗪-1-羧酸(PCA)是一种广泛存在于假单胞菌和链霉菌等微生物中的次级代谢产物,对多种植物病原真菌或细菌具有较好的抗菌活性,同时还有医用杀菌、抗肿瘤等活性,应用比较广泛[20]。国内以PCA为有效成分开发的农药产品被命名为申嗪霉素,已获得农药登记,用于防治小麦赤霉病、稻瘟病、稻纹枯病、黄瓜霜霉病、辣椒疫病等真菌或卵菌病害。本研究用绿针假单胞菌TC3产生的PCA来测定对梨火疫病菌的抗菌活性,其单体化合物EC50为46.41 μg/mL,该活性比目前登记的中生菌素要弱,与春雷霉素相当,比噻唑锌稍好,因此也有一定的研究和应用价值。将PCA与中生菌素进行复配,发现9∶1的配比有一定相加作用(SR=1.28),但尚未达到增效的作用,推测两者的作用机制有相近之处。2-羟基吩嗪-1-羧酸(2-OHPCA)和2-羟基吩嗪(2-OHPHZ)也是假单胞菌产生的主要吩嗪类化合物,本研究显示其抗梨火疫病菌作用很弱(EC50高于1 000 μg/mL),从化学结构上可以看出,吩嗪基团2号位上的羟基基团对于梨火疫病菌抗菌活性来说是不利的(图1),该结果为未来开展化合物的结构改造以提高抗菌活性提供了参考和依据。

中生菌素、春雷霉素、噻唑锌、噻霉酮等农药是目前登记防治梨火疫病的药剂,室内抗菌活性也有报道。如梁慧敏等[7]通过最低抑制浓度和抑菌圈比较的方法测定了30种药剂对梨火疫病菌的抗菌活性,发现噻霉酮、壬菌铜、乙蒜素、假单胞菌等效果较好,不同药剂之间、同一药剂不同剂型之间抑菌效果差异较大。热孜亚·麦麦提等[21]通过滤纸片-抑菌圈法测定了噻霉酮药剂对梨火疫病菌50个菌株的抗菌活性,发现不同地区、不同寄主和年份的梨火疫病菌菌株对噻霉酮的敏感性、抗性水平都存在一定差异,噻霉酮对供试菌株的EC50范围为12.40～813.13 μg/mL,均值为(304.61±133.45)μg/mL。相比于前人结果,本研究测定的药剂活性大小有所差异,可能的原因有很多,一是所用药剂产品不同,本研究使用的药剂多为纯度较高的抗生素标准品,与前人使用的农药制剂不同,药剂的物理状态、抗菌性能有差异;二是梨火疫病菌菌株不同,不同菌株对同一药剂的敏感性存在差异;三是测定方法不同,本研究使用病原菌培养液的OD600反映菌体浓度大小,进而反映不同药剂的抑制作用大小,前人使用抑菌圈大小来评价药剂抑制效果,两种方法得到的EC50必然有差异。但总的来说,这些研究结果均显示了中生菌素、噻霉酮等药剂的EC50较低,为梨火疫病的防治提供了一定的理论依据。

本研究测定了5个吩嗪类化合物对梨火疫病菌的抗菌活性,明确了堆囊粘菌素、吩嗪-1-羧酸等化合物的活性较好,但仍有很多问题尚待研究,如该化合物对不同地区、时期的梨火疫病菌是否有相似的抗菌活性尚需研究,化合物的复配筛选范围有待进一步扩大,化合物的制剂产品在田间是否有较好的防治效果也需进一步研究。本研究结果为扩充梨火疫病防治药剂种类、开发利用吩嗪类化合物提供了参考。