海南三亚崖州湾科技城发现番石榴果实蝇

李维松,颜晓蕊,3,杨文钊,殷崇文,3,曾 琴,3,冯晓东,王晓亮,秦誉嘉,3,郭韶堃,3,柳丽君,3,赵紫华,3,李志红,3*

(1.中国农业大学植物保护学院植物生物安全系,北京 100193;2.农业农村部植物检疫有害生物监测防控重点实验室,北京 100193;3.三亚中国农业大学研究院,三亚 572000;4.全国农业技术推广服务中心,北京 100125)

实蝇隶属于双翅目Diptera实蝇科Tephritidae,目前世界已知约500个属,4 500余种,约250种实蝇具有重要的经济意义,其入侵防控受到全球高度关注[1-3]。番石榴果实蝇Bactroceracorrecta(Bezzi),属实蝇科Tephritidae果实蝇属Bactrocera,被中国、韩国、日本、古巴、墨西哥等列为进境检疫性有害生物,引起世界各国植物检疫机构高度重视[2,4]。该虫寄主范围广泛,可为害番石榴、莲雾、芒果、樱桃、腰果等30个科60余种植物[2,5],以热带及亚热带的果蔬植物为主。其雌成虫在寄主果皮下产卵,孵化的幼虫蛀食造成果实品质降低,经济损失严重[2,6]。在印度南部,番石榴果实蝇对番石榴的为害率最高可达80%,远超其他实蝇类害虫[6],在泰国,番石榴果实蝇同橘小实蝇Bactroceradorsalis(Hendel)被认为是影响芒果和番石榴生产的主要害虫[7]。

番石榴果实蝇首次于1916年在印度东北部比哈尔报道发生[8],现广泛分布于不丹、缅甸、尼泊尔、巴基斯坦、斯里兰卡、泰国等南亚及东南亚国家[2,9];该虫于1986年在美国的加利福尼亚州及佛罗里达州监测到发生,美国已于2015年宣布该虫被彻底根除[10-11]。在我国,番石榴果实蝇首次于1989年在云南元江、漠沙报道发生[12],Qin等基于mtDNAcox1基因及12个微卫星标记位点,对世界主要分布区番石榴果实蝇的种群遗传结构及入侵路线进行分析,推测出番石榴果实蝇具有从南亚到东南亚再到中国云南的扩散趋势[13]。我国于2003年-2011年,在云贵川及广西4省区108个市县进行监测,结果表明,番石榴果实蝇起初仅分布于云南纵向岭谷区部分市县,而后逐步向云南北部扩散,西北至六库地区,中北至金沙江流域元谋一带,滇东扩散至南盘江流域盘溪。2009年-2011年番石榴果实蝇已入侵至四川攀枝花和米易[14]。2017年3月,番石榴果实蝇于广西百色、田阳被监测发现,该地距番石榴果实蝇最近报道的云南东部地区300 km[15],进一步表明番石榴果实蝇已经出现由云南向外扩散的现象。

番石榴果实蝇在18～33℃条件下,各阶段发育历期与温度呈现正相关关系,实验室条件下控制温度25～34℃,相对湿度70%,其完成1个世代仅需30 d左右[16-17]。海南省地处热带北缘,全年平均温度24℃以上,雨水充沛,是我国重要的热带水果产区,出口约180多个国家和地区。三亚市地处海南省南部,温度、湿度等气候条件非常适合实蝇类害虫生长发育;近年来三亚市果蔬产业快速发展,果蔬的产量直接影响农民生活质量及三亚市整体经济[18],该虫入侵为害将影响莲雾、芒果、番石榴等海南优质热带水果的生产和出口贸易,因此避免番石榴果实蝇入侵为害至关重要。本研究通过对在海南省三亚市崖州湾科技城诱捕到的500头实蝇成虫样品进行形态鉴定,随机挑取5头实蝇成虫样品进行DNA条形码及常规PCR鉴定,证实诱捕到的实蝇成虫为番石榴果实蝇,为相关植物检疫部门进一步加强对其监测防控,防止此类实蝇科害虫扩散蔓延提供决策支持。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究于2021年10月至2022年6月连续9个月在海南省三亚市崖州湾科技城(18.32°N,109.16°E),通过悬挂诱捕器,放置甲基丁香酚(ME)、诱蝇酮(CUE)及蛋白诱剂诱集到橘小实蝇、瓜实蝇Zeugodacuscucurbitae(Coquillett)及疑似番石榴果实蝇,从中分离出疑似番石榴果实蝇并随机选取供试实蝇成虫共500头进行形态鉴定,参考植物检疫抽样技术规则[19],按1% 抽样率从500头中随机挑取5头进行分子鉴定,编号为(HNSY1～HNSY5),全部样品置于装有无水乙醇的离心管中液浸,-80℃冰箱冻存。

1.2 方法

1.2.1形态鉴定

在Olympus(SZ51)体视镜下观察500头供试实蝇成虫样品的形态特征,并根据《实蝇类重要害虫鉴定图册》[5]所描述的番石榴果实蝇鉴定特征与之比对。

1.2.2DNA条形码鉴定

1.2.2.1DNA提取

单头实蝇基因组DNA提取按照姜帆的方法[20],使用天根生化科技(北京)有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取完成后,在Q5000超微量紫外分光光度计下(美国Quawell),取1 μL DNA模板测量其纯度及浓度。

1.2.2.2PCR扩增及测序

参照Folmer等[21]设计的LCO1490/HCO2198引物对(引物由北京擎科生物科技有限公司合成),使用VeritiTM96-well Thermal Cycler PCR仪(美国Applied Biosystems),扩增实蝇成虫样品mtDNAcox1基因,扩增片段大小 658 bp。扩增体系为25 μL:2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR程序为94℃ 3 min;95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min,35个循环；72℃延伸10 min。

反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,用0.01% Gene Green [天根生化科技(北京)有限公司]染色,以D2000 DNA marker 为分子标记,最后在Gel Logic 212 PRO凝胶成像分析系统(美国Carestream Kodak)中观察结果。检测合格的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司进行双向测序。

1.2.2.3序列分析

测序结果利用DNAMAN 5.2.2.0进行拼接处理[22],得到5头实蝇样品DNA条形码序列。利用Bold Systems v4的IDENTIFICATION-Species Level Barcode Records功能对所获得的5条实蝇DNA序列进行比对，从而确定供试实蝇样品种类(相似性≥98%时判定为同一种)。

1.2.2.4构建系统发育树

利用MEGA 7分析软件[23]的Kimura 2-parameter模型,邻接(NJ)法，构建本研究所得5条DNA条形码序列与GenBank中不同地理种群及近缘种的DNA条形码序列(表1)系统发育树,以枣实蝇Carpomyavesuviana为外群。

表1 从 GenBank 中选取的用于构建系统发育树的DNA 序列Table 1 Selected DNA sequences from GenBank for constructing phylogenetic trees

1.2.3番石榴果实蝇的PCR鉴定

参考Jiang等[24]基于mtDNAcox1基因设计的番石榴果实蝇特异性引物对BCOR-F/BCOR-R(5′-TGACTTGTCCCCCTAATACTG-3′/5′-GTCGATCG-

CATGTTAATAACG-3′)进行扩增。引物对由北京擎科生物科技有限公司合成,扩增片段大小281 bp。扩增体系为25 μL:2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,ddH2O 10.5 μL。PCR程序为95℃ 3 min;95℃ 15 s,60℃退火延伸1 min,30个循环后60℃延伸1 min。

反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,用0.01% Gene Green染色,最后在凝胶成像系统中观察结果。

2 结果与分析

2.1 形态特征鉴定结果

经形态鉴定500头供试实蝇成虫样品均为番石榴果实蝇,主要形态鉴别特征如下:成虫体色黑黄相间;头部具颜面斑1对,呈黑褐色,颜面斑向中部相连形成深色横带(有时不连接);中胸背板呈黑色,缝后两侧黄条纹平行,延伸至后翅上鬃后,肩胛、背侧胛及小盾片黄色,小盾片基部具黑色横带;翅前缘带褐色,终于r1室的末端,在r2+3室的下端和r4+5室的上端形成狭褐斑(图1)。

图1 番石榴果实蝇主要形态鉴定特征Fig.1 The main morphological identification features of Bactrocera correcta

2.2 DNA条形码鉴定结果

本研究选取的5头采自海南省三亚市崖州湾科技城的实蝇成虫样品测序所得的658 bp DNA条形码序列,与Bold Systems v4数据库中番石榴果实蝇序列对比,相似性为99.49%～100%,结果表明随机挑选的5头实蝇成虫样品均为番石榴果实蝇。

基于邻接(NJ)法构建的系统发育树结果如图2所示,本研究所获5条DNA条形码序列与GenBank中记录的番石榴果实蝇序列聚在同一分支上且为单系,与DNA条形码序列比对结果一致。

图2 基于邻接法构建的番石榴果实蝇及其近缘种系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of Bactrocera correcta and its relatives based on neighbor-joining method

2.3 PCR鉴定结果

以番石榴果实蝇特异性引物对实蝇成虫样品DNA进行PCR扩增,电泳检测结果如图3所示,条带清晰,片段大小为281 bp,进一步说明随机挑选的5头实蝇成虫样品为番石榴果实蝇。

3 结论与讨论

本研究从海南省三亚市崖州湾科技城采集到疑似番石榴果实蝇成虫样品,利用形态特征,DNA条形码及常规PCR等方法,对样品进行鉴定,确定诱集到的实蝇样品为番石榴果实蝇成虫。

番石榴果实蝇1989年首次在我国云南省报道发生后,近几十年来其已经呈现出向周边省份扩散的趋势。生态位模型表明番石榴果实蝇在我国的中、高适生区域主要包括云贵川高原、广东、广西、福建、台湾等地区[25]。羽化率模型表明从5月到9月,我国大部分地区均适合番石榴果实蝇的生长,对广东、广西、云南、海南等省份需全年加强监测;随着未来全球气温变化,番石榴果实蝇在我国的适生区将北移至33°N附近,原有的高度适生区和中度适生区范围面积明显扩大,新增江西大部和豫鄂交界地带为高度适生区;因此,若不加强番石榴果实蝇的检疫监测管理,其具有非常大的可能性入侵我国大部分省市[26]。综上所述,番石榴果实蝇如进一步扩散将对我国水果产区造成非常严重的破坏。

准确了解掌握实蝇科害虫入侵机制及入侵来源有助于完善入侵防控的管理体系和技术体系[3],但目前有关番石榴果实蝇的入侵机制及防控技术的研究仍非常缺乏;Gu等针对番石榴果实蝇及橘小实蝇在高温下的热驯化机制进行探究,结果表明两种实蝇在45℃高温下均表现出驯化现象,增强了抵御高温胁迫的能力;在35℃下,许多热激蛋白基因(Hsps)仅在番石榴果实蝇中上调[27],此结果能合理解释目前番石榴果实蝇在我国主要分布现状及为何在温度更高的印度南部地区具有比其他实蝇更高的为害率,为进一步研究其入侵机制奠定了基础。

海南省地处热带北缘,岛内物产丰富,国内外贸易往来频繁,2020年6月,中共中央、国务院印发《海南自由贸易港建设总体方案》,这标志着我国扩大对外开放,积极推进全球经济一体化的决心和毅力,是重大的历史机遇也是挑战[28]。方案中明确指出要以海南南繁科研育种基地为基础,建设全球动植物种质资源引进中转基地,充分利用国内外资源,丰富我国种质资源,推动我国种业不断创新发展,服务于国家重大战略决策[29]。此次在三亚崖州湾科技城发现番石榴果实蝇,笔者认为亟须在海南开展番石榴果实蝇田间调查、样品收集、精准鉴定，从而确定其发生范围及寄主范围,以及基于基因组学等明确其来源,采取必要措施控制其发生扩散,以避免对海南优质热带水果种质及产品出口造成影响,促进海南自贸港及全球动植物种质资源引进中转基地的建设。

总的来说,本研究证实海南三亚崖州湾科技城诱集到的疑似番石榴果实蝇样品为番石榴果实蝇。笔者建议相关植物检疫机构应加强对番石榴果实蝇适生区的检疫、监测及防控,以防止其进一步扩散蔓延至我国其他省份。此外,需系统性开展番石榴果实蝇快速检测鉴定技术、种群溯源技术、检疫处理技术的研究与应用,加强番石榴果实蝇入侵机制研究,从而为番石榴果实蝇入侵防控、保护农业生产安全、促进我国果品出口提供理论依据及技术支持。