警惕番茄褐色皱纹果病毒在我国的传播和危害

石钰杰,马子玥,杨秀玲,周雪平

(中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

番茄作为世界各地广泛种植的蔬菜作物,具有良好的营养价值和经济效益。然而,番茄生长过程中经常遭受多种病毒病的危害,造成严重的产量损失和品质下降。据报道,目前至少有22科39属的312种病毒、卫星病毒或类病毒能够侵染番茄,主要包括菜豆金色花叶病毒属Begomovirus、烟草花叶病毒属Tobamovirus、番茄斑萎病毒属Tospovirus、黄瓜花叶病毒属Cucumovirus和马铃薯Y病毒属Potyvirus病毒[1]。

番茄褐色皱纹果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)是杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属的一个新种。自2014年首次在以色列发现以来,ToBRFV发生蔓延的速度极快,在欧洲、美洲、亚洲和非洲的多个国家对番茄或辣椒等作物的生产造成重大威胁,被欧洲和地中海植物保护组织(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)列为警戒名单。2021年4月ToBRFV被农业农村部列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。本文将综述ToBRFV的发现与分布、基因组结构、传播方式、寄主范围、检测方法以及防控措施等内容,为控制ToBRFV在我国的扩散与危害提供基础。

1 ToBRFV的发现与分布

2014年10月,以色列南部Ohad村庄温室内约12.14 hm2的番茄出现轻微或重度花叶,偶尔叶片变窄,果实呈现黄色斑点的症状[2]。随后不到一年,该病害就已传播到以色列大多数番茄种植区,但当时并不清楚危害番茄的病原物类型[2]。2015年4月,约旦温室栽培的番茄出现轻微花叶、叶片畸形的症状,且果实出现严重的褐色皱纹,发病率接近100%,极大地影响了番茄的商品价值;利用分子生物学和生物信息学等手段对危害番茄的病原物进行鉴定,发现约旦的发病番茄是由一种新的烟草花叶病毒属病毒(tobamovirus)引起的,命名为番茄褐色皱纹果病毒[3]。2017年,以色列报道了2014年其南部暴发的番茄病害的病原物与约旦报道的ToBRFV约旦分离物的基因组序列高度相似,且能侵染携带Tm-1、Tm-2、Tm-22抗性基因的番茄品种和携带L1,3,4抗性基因的辣椒[2]。2018年9月,在墨西哥米却肯州的几个种植番茄和辣椒的农场中首次检测到ToBRFV病毒[4],这是关于ToBRFV在自然条件下侵染辣椒的首次报道。随后,ToBRFV呈现快速扩展、严重危害的态势,尤其在番茄主产区的扩散速度更快,危害性也更大。

目前该病毒已在亚洲、欧洲、北美洲和非洲的35个国家被发现并报道[5],分别为:欧洲的德国[6]、意大利[7]、土耳其[8]、希腊[9]、荷兰[10]、英国[11]、西班牙[12]、法国[13]、挪威[14]、瑞士[15]、阿尔巴尼亚[16]、塞浦路斯、比利时、波兰、捷克、马耳他、匈牙利、保加利亚、奥地利、爱沙尼亚、斯洛文尼亚和葡萄牙;美洲的墨西哥[4]、加拿大[17]和美国[18-19];亚洲的以色列[2]、约旦[3]、中国[20]、巴勒斯坦[21]、乌兹别克斯坦、伊朗[22]、沙特阿拉伯[23]、叙利亚[24]和黎巴嫩[24]以及非洲的埃及[25](表1)。这些国家包括6个位居世界前10位的番茄生产国(中国、美国、土耳其、意大利、西班牙和墨西哥)和2个世界主要番茄种子生产国(以色列和荷兰)。我国于2019年4月首次在山东禹城温室栽培的番茄上发现ToBRFV危害,发病面积0.27 hm2,发病率达50%[20];2020年在北京、陕西和云南元谋的番茄上也发现感染ToBRFV的番茄样本[26-27]。

表1 番茄褐色皱纹果病毒在全球的发生分布情况1)Table 1 Distribution of ToBRFV around the world

2 ToBRFV的基因组结构与系统进化关系

ToBRFV的病毒粒体呈杆状,长约300 nm,宽约18 nm;基因组为一条正义单链 RNA(+ssRNA),长约6.4 kb。与其他烟草花叶病毒属病毒的基因组结构相似,ToBRFV的基因组包含5′和3′端非翻译区以及4个开放阅读框,分别为ORF1、ORF2、ORF3和ORF4 (图1)。ORF1编码约126 kD的复制酶,ORF2与ORF1的起始位点一样,通过密码子通读的方式编码183 kD的复制酶,ORF1和ORF2编码的复制酶参与病毒的复制;ORF3编码30 kD的运动蛋白(movement protein,MP),MP是ToBRFV突破Tm-22介导的抗性的重要因子[28-29];ORF4编码17.5 kD的外壳蛋白(coat protein,CP),与病毒粒子的组装和病毒的系统移动相关。

图1 番茄褐色皱纹果病毒的基因组结构[27]Fig.1 Genome organization of tomato brown rugose fruit virus [27]

截至2022年3月,NCBI中已经登录的ToBRFV的全长基因组序列多达78条。对ToBRFV及烟草花叶病毒属的代表性病毒的全长基因组序列进行系统进化树分析,发现ToBRFV与同属的烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)亲缘关系较近﹐其次是番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)和番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaic virus,ToMMV)[2,5]。对ToBRFV的全长基因组序列与其他的烟草花叶病毒属病毒的序列进行分析,发现ToBRFV与TMV的序列一致性最高,在82%左右,与ToMV和ToMMV的相似性在81%左右[2,27]。

3 ToBRFV的传播方式

ToBRFV非常稳定且极易传播和侵染。在温室等保护性设施中,ToBRFV主要通过接触传播,是其近距离扩散的主要方式。带毒的繁殖材料、被病毒污染的植物、衣服、手和水以及嫁接和整枝打杈等农事操作和农业器械均可以传播ToBRFV[30]。种子传播是ToBRFV远距离传播的主要方式之一。尽管ToBRFV仅存在于种皮中,但染毒番茄的种子100%带毒[31-32]。虽然带毒种子传播ToBRFV的效率比较低,为0.08%～2.8%[33],但是被病毒污染的种子可作为初侵染源,一旦长成带毒植株,病毒可通过接触传播进一步扩散蔓延。此外,带毒种子一旦随着进出口贸易扩散,在条件适宜的情况下,很容易在新的国家和地区定殖。有研究表明,授粉昆虫熊蜂Bombusterrestris若携带ToBRFV,可在授粉时将ToBRFV传播到健康的番茄植株上[34]。

4 ToBRFV的寄主范围

在自然条件下,ToBRFV可侵染番茄和辣椒。一般来说,ToBRFV侵染番茄产生的典型症状包括花叶、叶上深绿色突起、叶片变窄、叶片畸形(图2a),在番茄生长后期,果实可出现坏死、环斑(图2b)。ToBRFV在番茄上的症状表现可能受番茄品种、危害时期和环境条件的影响。例如,ToBRFV约旦分离株在温室感染的番茄叶片仅表现轻微花叶与畸形,而果实却出现严重的褐色皱纹[3];ToBRFV在以色列南部的番茄上产生轻微或严重的花叶症状,且发病番茄上有10%～15%的果实出现黄斑症状[2]。ToBRFV危害辣椒主要引起植株发育迟缓,叶片花叶、斑驳、黄化和坏死斑,果实出现褐色皱纹。ToBRFV侵染辣椒所产生的症状也与品种密切相关。例如,ToBRFV能够系统侵染含有L1或L2抗性基因的辣椒,而侵染含有L3或L4抗性基因的辣椒时会出现过敏性反应,从而限制ToBRFV的侵染[35]。

在实验室条件下,除模式植物本氏烟Nicotianabenthamiana外(图2c),ToBRFV还能系统侵染茄科、苋科、夹竹桃科和菊科的30余种植物[2-3,24,36-38]。ToBRFV系统侵染普通烟N.tabacum、心叶烟N.glutinosa、毛叶烟N.tabacumcv.‘sylvestris’、克利夫兰氏烟N.clevelandi、澳可烟N.tabacumcv.‘occidentalis’、黄花烟N.tabacumcv.‘rustica’、三生烟N.tabacumcv.‘Samsun’、麦格隆熄丰烟N.megalosiphon、白肋烟N.tabacumcv.‘White Burley’、墙生藜Chenopodiummurale、藜C.album、千日红Gomphrenaglobosa、一点红Emiliasonchifolia、茼蒿Glebioniscoronaria等植物并产生症状;无症侵染苋色藜C.amaranticolor、昆诺藜C.quinoa、曼陀罗Daturastramonium、洋金花D.metel、矮牵牛Petunia×hybrida和龙葵Solanumnigrum(或侵染后引起黄化症状)等植物;但该病毒不能侵染拟南芥Arabidopsisthaliana、含有N基因的三生烟、马铃薯Solanumtuberosum、茄子S.melongena和西葫芦Cucurbitapepo等植物。

图2 ToBRFV在番茄和本氏烟上的症状Fig.2 Symptoms induced by ToBRFV in tomato and Nicotiana benthamiana plants

5 ToBRFV的检测方法

与很多植物病毒相似,ToBRFV发生后无药剂可以治疗,且ToBRFV可随种子传播。因此早期诊断监测预警是控制ToBRFV扩散蔓延的关键。目前已开发的ToBRFV的检测方法主要包括用于检测ToBRFV RNA的分子生物学方法以及用于检测ToBRFV外壳蛋白的血清学检测方法。

基于ToBRFV RNA的检测方法包括RT-PCR、微滴式数字PCR、多重PCR、环介导等温PCR (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和基于CRISPR/Cas的检测[17,36-37,39-44]。RT-PCR和微滴式数字PCR具有较高的灵敏度和特异性,可用于检测叶片和种子样品中的ToBRFV。Yan等还针对ToBRFV、TMV、ToMV和番茄斑萎病毒开发了多重RT-PCR,可用于同时检测待检样品中是否含有上述4种病毒[37]。然而,RT-PCR、微滴式数字PCR和多重PCR均需要精密的仪器以及专业的工作人员,无法直接在田间使用。LAMP是在等温环境下反应,可通过肉眼观察进行结果判断,可用于在田间直接进行ToBRFV的检测。

基于ToBRFV CP的检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)以及胶体金免疫试纸条,高质量的抗体是该检测技术建立的关键。Bernabé-Orts等[45]获得了两个能够特异且灵敏识别ToBRFV的单克隆抗体,且与TMV和ToMV无交叉反应。2021年闫志勇等[46]开发了能够在5 min之内快速检测ToBRFV的胶体金免疫试纸条,作者与浙江大学合作获得了能够特异且灵敏识别ToBRFV的单克隆抗体,开发出了斑点免疫检测试剂盒和胶体金免疫试纸条(数据未发表),为ToBRFV的快速检测提供了重要工具。

6 防控建议

如前所述,ToBRFV发生之后无药剂可以治疗,且目前生产上缺乏抗ToBRFV番茄品种。为有效控制ToBRFV在中国的扩散与蔓延,需要构筑早期预警、准确监测和阻截控制三道防线。

首先,加强检疫。ToBRFV可通过种子传播。虽然ToBRFV随种子传播的效率比较低,但是一旦带毒种子进入新的国家或地区,ToBRFV将进行远距离传播。选用无毒种子和种苗是控制ToBRFV的基础。为避免ToBRFV在国内扩散,应设立疫区与非疫区,并强化番茄和辣椒种子或种苗调运监管,发现疫情及时处理与通报。

第二,加强监测预警。ToBRFV发生初期不容易被发现,显症后极易暴发流行。只有在病害发生初期检测出病毒的种类,才能采取快速有效的干预措施,防止病毒的进一步扩散流行。因此,在番茄和辣椒主产区应加强巡查,发现ToBRFV病株及时销毁。

第三,加强田园清洁。ToBRFV容易通过接触传播。在进行整枝打杈等农事活动时,尽量佩戴一次性手套和鞋套,每次处理新植株前需消毒器具。有报道表明,2%盐酸处理30 min或者用10%磷酸三钠处理3 h可将ToBRFV彻底消除;另外,0.5%乳铁蛋白、2%裴赛斯(Virocid)、10%次氯酸钠和3%卫可 (Virkon)对ToBRFV有90%以上的灭活效果[47-48]。

第四,选育抗病品种。利用抗病品种是防治病毒病最有效的方法。因ToBRFV能侵染携带Tm-1、Tm-2、Tm-22抗性基因的番茄品种,目前生产上尚无商品化的抗病品种。因此,应加强番茄、辣椒种质资源对ToBRFV的抗性评价,并将筛选出的抗性资源整合进行常规育种。此外,还应加强ToBRFV致病机制和植物抗病毒机制的研究,挖掘抗ToBRFV的基因,为研发培育抗ToBRFV新品种提供技术储备。

7 结论

我国是世界上番茄、辣椒种植面积最大、生产总量最多的国家之一,番茄和辣椒是农民增收的重要支柱。自首次发现以来,ToBRFV在短短几年的时间就迅速蔓延至全球35个国家。尽管目前在自然界中仅发现ToBRFV危害番茄和辣椒,但实验室条件下ToBRFV的寄主范围非常广泛。虽然 ToBRFV 在中国番茄、辣椒产区只有零星发生,但我们仍有必要加强ToBRFV的检疫和监测预警,警惕ToBRFV在我国的进一步扩散和蔓延。使用抗性品种是控制病毒病最经济有效的手段,然而目前并没有商业化的抗病品种。因此,亟须加强野生番茄等不同类型的种质资源的筛选,获得ToBRFV的抗性材料;加强ToBRFV的侵染循环和致病机制的研究,并利用CRISPR/Cas等生物技术改造相应植物,为获得抗病毒材料提供靶标和思路。