一种快捷精准的组织芯片制作方法

徐龙宽，钟新梅，王文丽，伍爱华，韦 辉，李运千，莫长顺，周英琼，王绪明

组织芯片是将大量生物组织样本按预先设计的阵列图排列在同一蜡块上形成矩阵的微缩组织块[1]。组织芯片技术的建立实现了在一次实验中对大量样本进行平行研究，减少实验误差的同时，节省了试剂和时间，随着该项技术的不断发展，被广泛运用到免疫组化、原位杂交和荧光原位杂交等实验中。目前市场上的组织芯片成品价格昂贵，已有文献介绍组织芯片技术的制作及应用，但存在制作过程较复杂和位点较少等不足[2-10]。本文现介绍一种操作简单、经济实用的组织芯片制作技术，通过电脑设计微阵列网格纸，用包埋机制作空白受体蜡块，成型后用电磨笔打孔，最后用手持组织芯片枪获取供体组织芯片柱，制作组织芯片。

1 材料与方法

1.1 材料收集2021年8月桂林医学院附属医院病理科经病理检查的正常扁桃体、胎盘和肝脏组织，包埋成供体蜡块。

1.2 主要耗材及仪器优质包埋石蜡(熔点57～60 ℃，广州维格斯公司)，手动组织芯片取样枪(型号1026，广州洁利公司)，手持微型电磨笔(琨匠voltage，3.7v，上海钦同公司)，组织包埋机(Thermo Histostor)，电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9070A，上海精宏公司)，高速黑白激光打印机(brotherHL-2140)，切片机(Leica RM2235)，常规不锈钢包埋底模(规格：37 mm×24 mm×9 mm，江苏世泰公司)，黏附载玻片(海门曙光器材厂)，普通A4纸。

1.3 方法

1.3.1制作工具 电磨笔配套直径1.0、1.5、2.0 mm的麻花钻头，用于受体蜡块的打孔(图1)，手动组织芯片取样枪配套直径1.0、1.5、2.0 mm的枪头，用于供体蜡块的取样及组织芯在受体蜡块的植入(图1)。

图1 制作工具：A.手持微型电磨笔；B.电磨笔对应麻花钻头；C.取样枪配套对应的枪头；D.手动组织芯片取样枪 图2 自制7×11位点、8×13位点和10×16位点正方格网格纸及日常使用的不锈钢底模 图3 打孔前(上图)及打孔后(下图)的蜡模 图4 8×13位点组织芯片HE染色低倍镜(左图)和高倍镜(右图)图片 图5 8×13位点组织芯片Hep Par-1蛋白免疫组化染色低倍镜(左)和高倍镜(右)图片 图6 8×13位点组织芯片Ki-67蛋白免疫组化染色低倍镜(左)和高倍镜(右)图片

1.3.2受体蜡块的制作 (1)在Microsoft Word 2007中插入表格，选择表格属性，在表格-选项-默认单元格边距中将上下左右均设置为0；行指定高度选择固定值，列指定宽度，行和列的数值均比芯片孔径大1 mm，如1.0 mm孔径组织芯片，表格的行和列均设为2 mm；A4纸打印正方格网格纸，裁好后备用。采用上述方法可设计160(10×16)位点、104(8×13)位点及77(7×11)位点3种不同规格大小的微阵列，分别应用于1.0、1.5、2.0 mm的组织。(2)裁剪好的网格纸置于包埋底模底部包埋成型后备用(图2)。(3)用电磨笔配套相应孔径的麻花钻头垂直于受体蜡块对应网格打孔。(4)去掉网格纸，用切片机按10 μm厚度粗修受体蜡块至平整(图3)。

1.3.3供体蜡块的处理 (1)用切片机粗修(5 μm)供体组织蜡块，暴露组织至需要区域。(2)粗修后组织蜡块置于37 ℃烘箱中预热30 min软化[4]，避免打孔时因组织过硬出现裂痕。

1.3.4组织芯片的制作 (1)使用组织芯片取样枪在处理好的供体蜡块上取出需要的组织芯柱。(2)将组织芯柱植入对应受体蜡块孔位。(3)全部移入后用玻璃板压平，尽量使组织在同一平面。(4)将组织芯片蜡块放入底模，使包埋盒在上，组织芯在下，保证组织芯柱落在同一平面上，平整放入预热到57 ℃的烘箱中加热30 min，使组织芯与受体蜡块融为一体。(5)关闭烘箱，打开烘箱门自然冷却10 min后取出组织芯片蜡块，置于包埋机冷冻台冷却10 min。(6)冷却后迅速敲出组织芯片。(7)切片机上稍粗修(5 μm)至最大切面，组织芯片蜡块即制作完成。

1.3.5切片 组织芯片蜡块置于4 ℃冰箱中充分预冷4 h后用切片机切取白片[5]。将切片放入46 ℃温水中充分展片，用黏附载玻片捞取切片，自然晾干后65 ℃烤片2 h待用。

1.3.6HE染色 组织芯片进行常规HE染色，显微镜下评估组织芯片的HE染色效果。

1.3.7免疫组化 组织芯片以Hep Par-1、Ki-67抗体染色，染色方法为罗氏Ventana全自动免疫组化染色步骤。

2 结果

2.1 组织芯片成功制备组织芯片蜡块，组织芯柱与受体蜡块结合紧密，位点排列整齐，无移位、变形、缺失，未见开裂及气泡产生。

2.2 HE染色结果以104(8×13)位点为例，制作的组织芯片染色结果显示，各位点组织形态结构及细胞结构均清晰可辨(图4)。

2.3 免疫表型以104(8×13)位点为例，组织芯片Hep Par-1(图5)及Ki-67(图6)免疫组化染色结果显示，Hep Par-1蛋白表达定位于肝细胞胞质，Ki-67蛋白表达定位于细胞核，其蛋白定位分布、染色强度及特异性与常规石蜡切片行免疫组化染色相符。

3 讨论

组织芯片因其规模大、高通量、标准化等优点，具备十分重要的科研价值，目前最为标准的制作方法为运用全自动组织芯片仪制作，但设备昂贵，成本较高导致难以普及，而手工制作方法种类较多，主要有需要受体蜡块[3-5,7-9]和浇注式[2,6,10]两大类。浇注式对操作者的操作水平要求较高，且芯片阵列易出现错乱现象；而需要受体蜡块的方法可通过购买商品化的受体蜡块[4,7]或手工自制[3-5,8-9]，商品化受体蜡块成本较高，需要二次增加固相支撑(包埋盒)的步骤，过程繁琐且温度较难掌控，常因受体蜡块和组织芯柱融合不佳导致切片时出现开裂；手工自制的规格不统一，位点排列不规范，制作过程较繁琐。本方法的优点：(1)电脑设计排列位点灵活标准；(2)微阵列网格纸直接黏附于受体蜡块，打孔位点排列整齐；(3)受体蜡块和固相支撑一次成型，黏附牢固；(4)钻头和组织枪孔径标准化且有不同规格可选择；(5)成本较低；(6)实验重复性好，操作简单；(7)切片染色质量较好，位点变形率、丢失率低。

为提高芯片制作的效率及质量，总结几点经验：(1)网格纸在包埋时要尽量贴近底部铺平，防止包埋时因网格纸不平整导致受体蜡块底部凹凸不平；(2)打孔时尽量垂直于网格纸，使各位点保持大小一致；(3)打孔后务必粗修受体蜡块使各位点在同一平面，避免后期切片时位点缺失；(4)选择供体蜡块时尽量避免较薄的组织，以免引起位点缺失；(5)芯片柱和受体蜡块融合时温度过高、时间过长，石蜡完全液化易引起点阵乱序，而温度过低时间过短则融合不充分影响切片，所以建议融合温度为石蜡熔点的下限，即57 ℃，时间在30 min以内，可以反复融合2～3次以达到理想状态；(6)切片时先将蜡块切至最大切面，4 ℃预冷30～60 min后直接切片避免再修片，可提高切片质量。

本方法采用电脑软件设计组织微阵列及电磨笔打孔，确保各点阵排列整齐，HE及免疫组化染色效果良好，取得满意的效果，无论在制作技术还是制作成本上均具有明显的优势，可在临床工作及科学研究中广泛开展。