基于生理指标的棉花耐高温品种筛选及与根系表型关系分析*

司 鹏 ,刘连涛 ,孙红春 ,张 科 ,白志英 ,李存东 ,张永江**

(1. 河北农业大学农学院/省部共建华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省作物生长调控重点实验室 保定 071000;2. 河北农业大学生命科学学院 保定 071000)

近年来,CO2、CH4等温室气体排放持续加重,导致全球气温呈逐渐上升的趋势[1]。联合国政府间气候变化专门委员会(IPCC)第5 次综合报告中指出,全球变暖带来一系列的气候问题,例如,极端气候出现的越来越频繁,导致热浪发生的频率增加且持续时间拉长[2]。2018 年,IPCC 的工作组特别报道中指出全球气温较工业化前上升1.5 ℃已经成为不争的事实[3]。棉花(Gossypiumspp.)属于喜温好光作物,但是超过一定耐受温度(通常认为是35 ℃)仍会导致高温胁迫。有研究表明,高温胁迫下,日最高温度每升高1 ℃会导致皮棉产量减少110 kg·hm-2[4]。随着全球气温上升,高温胁迫已经成为限制棉花生长发育的重要非生物胁迫之一[5-6]。因此,培育耐高温的棉花品种对未来棉花产量和纤维品质的提升至关重要。确定棉花耐高温品种特性,可为耐高温品种育种工作提供依据。

棉花花芽分化是从营养生长转向生殖生长的过程[7],此时易受高温胁迫的影响,六叶期处于棉花营养生长向生殖生长过渡,此时遭受高温胁迫对生殖生长不利[8]。高温胁迫下,棉花细胞内会产生活性氧(reactive oxygen species,ROS),造成氧化胁迫[9],激发超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)等活性氧清除系统酶类活性[10],从而降低高温伤害。高温胁迫下抗氧化物质的活性强弱可用来判断棉花的耐热性强度[11-13]。高温胁迫使细胞膜上的蛋白变性[14],破坏细胞膜的结构,改变细胞膜的透性,同时丙二醛(malondialdehyde,MDA)也会加剧膜损伤,使细胞液外漏,电解质大量外渗,相对电导率(relative conductance,RC)增加,这些与植株的耐热性密切相关。耐热品种可通过调控可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸等渗透调节物质含量,缓解渗透压的增加带来的伤害[15-16]。早在1994 年就有报道表明,在棉花苗期耐热性强的品种可溶性糖(soluble saccharide,SS)含量更高[17],但脯氨酸含量等没有明显变化规律[18]。

在适宜的温度范围内,温度和光合速率呈正相关,但当温度胁迫超过自身可调节范围时,净光合速率降低,呼吸作用会增强,导致同化产物的生成速率降低[5]。棉花高温胁迫时,叶片净光合速率(photosynthetic rate,Pn)、气孔导度(stomatal conductance,Gs)、胞间二氧化碳浓度(intercellular CO2concentration,Ci)和蒸腾速率(transpiration rate,Tr)随着胁迫时间的延长而下降[19]。高温胁迫下,棉花的耐热性越强,光合作用降低的幅度越小[20]。高温胁迫会导致叶绿体外膜和类囊体膜结构的破坏,促使叶绿素降解,含量下降,因此常用来鉴定植物的耐热性。叶绿素荧光参数PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)在非胁迫条件下变化较小,但经过胁迫条件后下降明显[21-23],也是植物耐热性的关键指标。

前人研究多侧重于高温胁迫对作物地上部的影响,对地下部根系的报道并不多见。根系是植株水分和养分吸收的关键器官,在遭受高温胁迫后,植物的根表面积、根长和根体积显著降低,根尖和根叉的数量增加[24];根生物量、根冠比、初生根长度、根表面积和根体积显著降低[25]。但高温胁迫下棉花根系表型特征与耐高温能力关系尚缺乏报道。本文选用黄河流域棉区15 个主栽的棉花品种,在正常和高温条件下,研究了叶片的10 个生理指标和4 个根系表型性状对高温的响应特征,通过主成分分析和相关分析,筛选耐高温的品种,解析耐高温能力与根系表型性状关系,为深入探究棉花耐热机理和品种改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

供试品种为冀中南棉区生产上常见的15 个品种,所有品种均由河北农业大学光温高效利用实验室提供。品种及编号如表1 所示。

表1 供试棉花品种及编号Table 1 Cotton cultivars tested in this study

试验在河北农业大学人工气候室内进行。选取饱满一致的种子经消毒冲洗后放置于湿润的毛巾上,在GXZ-430B 智能型培养箱(浙江,宁波)中培养,培养温度为25 ℃,暗培养24 h。选取萌发程度一致的种子,播种至直径15 cm、高13 cm 的培养钵中。培养基质按耕层土∶营养土=3∶1 的体积比进行掺混。每个品种种植10 个培养钵,每钵播3 粒种子,子叶展开后每钵留1 株,一半对照组(CK),另一半为高温组(HT)。出苗后保持基质中的相对含水量为(70±5)%,温室内环境参数设置如下: 昼夜时长12 h/12 h,昼夜温度25 ℃/25 ℃,光照强度为500 μmol·m-2·s-1。待植株生长至6 叶期,对照组(CK)继续保持原有培养条件,高温组(HT)进行高温处理,昼夜温度设置为35 ℃/30 ℃,其他条件与CK 保持一致,高温处理持续7 d。

1.2 测定项目与方法

处理7 d 后,选取长势一致的3 棵植株。选择主茎倒3 叶,用叶绿素仪(SPAD-502,日本)测定SPAD值,用便携式光合仪(LI-6400xt,美国)测定净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr),用植物效率分析仪(Handy PEA,英国)测定PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)。

取下主茎倒3 叶,先用去离子水冲洗叶片3 次,用吸水纸吸干,剪成长条状,黑暗条件下浸泡在10 mL去离子水中24 h,用电导率仪(雷磁DDS-307,中国)测得叶片的电导率R1;沸水浴30 min 后拿出,待恢复室温后,测得电导率R2,计算相对电导率RC=R1/R2。之后称取一定重量的叶片暂存在液氮后并转移到-80 ℃冰箱中,然后采用南京建成生物工程研究所有限公司的试剂盒测定SOD、POD、CAT 和SS。

将叶片取样完毕后,在子叶节处剪断,将地下部土壤冲洗干净,根系无重叠摆放在含1 cm 水深的亚克力透明盒中,采用爱普生扫描仪(Epson Expression 10000XL,日本)扫描根系,获得300 dpi 根系图像,然后用 WinRHIZO 软件(WinRHIZO Reg2009,加拿大)进行自动分析,获取根长(RL)、根表面积(RSA)、根体积(RV)和根平均直径(RAD)。

为验证结果的可靠性,将筛选出的耐高温品种和不耐高温的品种进行验证试验。试验前期条件与筛选试验一致,处理时期同为六叶期。白天进行35 ℃的高温处理,夜晚恢复25 ℃,处理一周后测定倒3叶Pn、Fv/Fm、CAT 和MDA 等耐高温代表性指标。

1.3 数据分析

数据分析采用Microsoft Excel 2016 和IBM SPSS Statistics 24 软件。利用主成分分析法(Principal Component Analysis,PCA)计算各个品种耐高温的综合评价得分,得分越高代表耐热性越强,再根据综合得分进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对不同棉花品种生理指标的影响

不同棉花品种在不同温度处理下各生理指标表现如表2 所示。高温处理后,SOD、POD、CAT、SS 和RC 总体上升,Pn、Gs、Tr、Fv/Fm和SPAD 总体下降。对于增加的5 个指标,所有品种高温处理均比常温对照处理平均分别增加199.2%、99.3%、81.1%、14.1%和8.3%,表明RC 对高温响应相对较敏感;对于降低的5 个指标,所有品种高温处理均比常温对照处理平均分别降低62.0%、60.7%、30.8%、23.0%和7.6%,表明Tr对高温响应相对较敏感。不同品种间各个指标表现各不相同。对于RC,高温处理比常温处理增幅最大的品种为‘冀228’,增幅最小品种为‘鲁棉研28’;对于Tr,高温处理比常温处理降幅最大的品种为‘农大601’,降幅最小的品种为‘冀228’。仅进行指标间的对比,难以得出高温处理后变化规律一致的品种。

2.2 高温胁迫下棉花生理指标的PCA 评价

本试验共涉及10 个相关指标,对这10 个指标的数据进行相关性分析,由表3 可知,高温处理下Pn和Gs与POD 相关性较差,Tr与SOD、POD、CAT和SS 的相关性较差,其余指标间均显著或极显著相关(P＜0.05,P＜0.01)。SOD、POD、CAT、SS 和RC是反映植物细胞内受损伤程度的指标,Pn、Gs、Tr、Fv/Fm和SPAD 则是反映植物光合生理的指标。为了方便数据处理,结合高温处理后不同指标的变化趋势,对这10 个指标进行降维处理,分为两部分: 一部分为SOD、POD、CAT、SS 和RC,称为综合指标1;一部分为Pn、Gs、Tr、Fv/Fm和SPAD,称为综合指标2。

表3 高温处理下棉花生理指标相关性Table 3 Correlation of physiological parameters of cotton under high temperature treatment

主成分分析可以用较少的变量解释大部分变量,将多指标转化为少数几个指标。通过主成分分析分别得到对照和高温处理下两组综合指标值计算表达式:

式中:x0-x9分别代表SOD、POD、CAT、SS、RC、Pn、Gs、Tr、Fv/Fm、SPAD。由表4 可知,KMO 检验值全部大于0.7,KMO 值越接近1,意味着变量间的相关性越强,原有变量越适合作因子分析;累计贡献率分别为80.762%、63.77%、75.942%和78.739%,除了高温胁迫下的综合指标1 累计贡献率较低外,另外3 个综合指标的累计贡献率都在75%以上,说明能够较好地反映主体信息。这2 组综合指标4 个表达式中,每个系数的值相差不大,表明在综合指标中所占的重要性相差不大。将各对照和高温处理的原始数据带入公式中,即可得对照和高温两组综合指标值(表4)。

表4 正常温度(CK)和高温胁迫(HT)条件下棉花的两个综合指标主成分分析Table 4 Principal component analysis of two comprehensive indexes of cotton under normal (CK) and high temperature (HT)treatments

2.3 不同棉花品种的耐热综合评价及筛选

综合指标1 和2 的HT 与CK 的比值为耐热系数,耐热系数有2 组,为了进行聚类分析,对耐热系数1、2 再次进行PCA 分析,最后得出各品种得分(表5)。‘硕丰1 号’品种得分最高,为5.64,表明在这15 个品种中耐热性最强;‘农大601’品种得分为1.62,在这15 个品种中耐热性最弱。根据品种得分进行系统聚类分析(图1),将15 个品种对高温的耐受程度分为3 种类型,第1 类为高温耐受性较强的品种:‘硕丰1 号’ ‘国欣9 号’和‘鲁棉研28’;第2 类为高温耐受性较弱的品种: ‘石抗126’ ‘邯无216’ ‘国欣4号’ ‘沧棉268’和‘农大601’;第3 类为中间型: ‘农大棉10’ ‘邯8266’ ‘冀228’ ‘国欣1号’ ‘冀863’ ‘冀棉315’和‘国欣2 号’。

图1 15 个棉花品种的耐热性聚类分析图Fig.1 Cluster analysis of heat resistance for 15 cotton cultivars

表5 基于主成分分析的棉花耐热系数及品种得分Table 5 High temperature resistance coefficients and cultivar scores of cotton based on principal component analysis

2.4 不同棉花品种耐高温得分与根系表型数据之间的关系

高温不仅对棉花地上部,也对地下根系产生影响。由表6 可知,高温处理后,棉花根长、根系表面积等指标均有不同程度地降低,其中,根长降低幅度最大的是‘农大601’,降幅达54.2%;降幅最小的是‘硕丰1号’,为16.1%。根表面积、根平均直径和根体积降幅最大的是‘国欣4号’,降幅分别为61.9%、13.9%和68.5%;根表面积降幅最小的是‘冀棉315’,为7.3%;根平均直径降幅最小的为‘冀228’,为1.3%,根体积降幅最小的为‘硕丰1号’,为21.4%。将高温处理下根系表型数据与对照的比值与品种得分进行相关性分析(表7),根长、根表面积、根体积和根平均直径与品种耐高温得分的皮尔逊相关系数为0.766(P＜0.01)、0.659 (P＜0.01)、0.628 (P＜0.05)、0.501(P＞0.05),表明越是耐高温的品种,根长、根表面积和根体积在遭受胁迫后减小的幅度越低。

表6 不同棉花品种高温处理下根系表型指标Table 6 Root phenotypic indicators of different cotton cultivars under high temperature treatment

表7 高温与对照棉花根系表型参数间及其参数比与品种得分的相关性Table 7 Correlation between root phenotypic parameters,and between parameter ratio of high and normal temperatures and cultivar score

为了对试验结果进行验证,将筛选出的耐热品种与不耐热品种再次进行高温试验处理,验证试验只在白天增温到35 ℃,夜晚恢复25 ℃,1 周后观测形态指标,发现耐热品种的Pn、Fv/Fm和CAT 大于不耐热品种,除‘沧棉268’的Pn与耐热品种不显著,其余指标差异均显著,耐热品种的MDA 显著低于不耐热品种(表8)。

表8 验证试验中耐高温和不耐高温棉花品种高温下的生理指标值Table 8 Physiological indexes of high temperature-resistant and high temperature-sensitive cultivars of cotton under high temperature in the verification test

3 讨论

棉花耐高温的鉴定方法、检测指标和分析方法较多,至今还没有统一的鉴定和评价标准,前人的研究中取样时期和测定指标较多,因此找到一个快速、高效、科学的筛选棉花耐高温的方法至关重要。其中耐高温鉴定方法应用较多的是花粉离体培养法,雄蕊对温度较为敏感[25],高温会使花粉活力降低,花粉萌发、花粉管伸长受到抑制,甚至完全受阻[25-26],棉花花粉离体培养耐受温度和萌发率越高,越能代表该品种具有一定的耐高温能力,因此常将散粉率和花粉萌发率作为耐高温的指标[27],但是用此方法需在棉花开花期进行,棉花前期培养的时间较长。本试验测定取样时期为苗期,试验周期较短,利用智能温室开展试验,其环境条件易于控制,较为稳定,受其他因素的影响较小,所有指标的测定也较为简便,而且本试验所有选定的指标都有相应的文献做支撑,同时本试验也可以为之后棉花耐热筛选提供相关思路。

已有研究表明,棉花苗期高温胁迫后,SOD、POD 和CAT 会呈上升的趋势,RC 显著增大,光合相关指标降低[11-13,16]。本研究测定了10 个与高温相关的指标,不同品种高温胁迫活性氧清除酶含量表现不尽一致,例如‘农大棉10 号’的SOD 和CAT 在胁迫之后略下降、POD 含量升高,‘石抗126’的POD含量降低、SOD 和CAT 的含量上升,但总体上活性氧清除系统的活性增强。植物体内的活性氧产生较复杂,同时活性氧清除系统的酶种类较多,因此不同品种的SOD、POD 和CAT 表现并不相同。本文还选择了对高温胁迫反应比较敏感的光合相关指标和细胞渗透调节相关指标,15 个品种的Pn、Tr、Gs和Fv/Fm在高温胁迫后全部呈降低趋势,高温胁迫抑制了棉花光合系统相关酶活性,可溶性糖含量、相对电导率呈上升的趋势,表明高温胁迫破坏了棉花的细胞膜结构,造成了细胞液外流,同时为了维持细胞的渗透压,增加了可溶性糖含量。本试验的10 个耐热性指标充分客观地反映了棉花的耐热性。测得的数据经过分析后发现,这10 个指标有一定的相关性,因此综合为两大类指标,在衡量耐热性上还具有一定的局限性,但本试验随后对筛选结果进行了验证,在验证试验中,只在白天进行了高温处理,耐热品种和高温敏感品种在Pn、Fv/Fm、CAT 和MDA 上均有一定的差异,且叶片萎蔫程度相差较大,表明本试验结果具有一定的准确性。

植物地上部和地下部之间是互相联系的,在以往的高温胁迫对棉花影响的研究中多集中于地上部,由于根系深埋在土壤中不利于观测和取样,同时土壤温度总是低于环境温度,因此对于高温胁迫与根系之间的研究内容较少,直到近些年才开始由地上研究为主逐渐转向地上地下兼顾[28]。在以往高温胁迫对根系表型研究的报道中较多为单一品种,本研究选择黄河流域棉区推广的15 个品种,将耐热性与根系表型数据进行相关性分析,探求棉花耐热性与根长、根表面积、根体积和根直径之间的联系。根系是作物吸收运输养分的主要器官,根长、根表面积越大,单位时间吸收的养分就越多,研究发现耐热性好的品种如‘硕丰1 号’ ‘国欣9 号’和‘鲁棉研28’,在高温胁迫1 周后根系表型指标降低的幅度比不耐热品种小,耐高温品种与不耐热品种相比,在高温胁迫后,根系吸收养分较多,蒸腾的水分也会更多,也会降低高温对叶片的损伤。在其他作物中如香菜(Coriandrum sativumL.)和水稻(Oryza sativaL.)的高温试验中发现耐热的品种根系活力更强[29-30],本文结果与之一致。在本试验中将品种的耐热性得分与根系表型数据之间进行了相关性分析,发现品种的耐高温能力与根长、根表面积极显著相关,与根体积显著相关,因此,根长、根表面积和根体积也可以作为高温筛选的指标。在育种工作中,可以挑选根长、根表面积和根体积相对较大的品种,育成的品种可能具有较强的耐热能力。

4 结论

对15 个黄河流域棉花品种研究表明,高温胁迫导致棉花叶片净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、Fv/Fm和SPAD 值降低;抗氧化酶SOD、POD 和CAT 活性,可溶性糖含量和相对电导率升高。利用主成分分析将10 个指标整合为2 个综合指标,得到不同品种的耐热系数和品种得分,聚类分析筛选出3 个耐高温品种: ‘硕丰1 号’ ‘国欣9 号’和‘鲁棉研28’,以及5 个不耐高温的品种: ‘石抗126’ ‘邯无216’‘国欣4 号’ ‘沧棉268’和‘农大601’。耐高温能力强的品种在受到高温胁迫后,根系表型指标值降低的幅度较小。明确了根长、根表面积和根体积也可以作为高温筛选的指标。