GeneXpert MTB/RIF技术在临床肺结核诊断中的应用

蒋泓宇，车洋，顾晓敏，桑国鑫，贺天锋

感染结核分枝杆菌引起的结核病是全球面临的热点公共卫生问题。WHO《2021年全球结核病年度报告》报道中国2020年新发患者数为84.2万，估算发病率为59/10万，居全球结核病高负担国家第2位[1]。结核病病原学检测对传染源的发现、确诊及临床治疗具有重要的意义[2]。目前，国内临床上检测结核分枝杆菌（MTB）仍然是以痰涂片镜检、固体（液体）培养法等传统检测方法为主。作为WHO推荐的一种实时荧光定量核酸扩增技术，GeneXpert MTB/RIF具有操作简便、自动化程度高及结果报告时间短等优势，已在国内部分地区进行了临床应用[3-5]。本研究以宁波地区结核病定点医疗机构2021年1—12月收集的1 649例疑似肺结核患者痰标本为研究对象，比较GeneXpert MTB/RIF技术与痰涂片及液体培养等传统检测方法在MTB检测敏感性和特异性等方面的差异，以进一步评价GeneXpert MTB/RIF在本地区临床肺结核诊断及利福平耐药检测方面的应用价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2021年1—12月宁波市奉化区人民医院门诊收治的具备完整检测信息的1 649例疑似肺结核患者痰液标本，其中男1 038例，女611例；年龄13～88岁，中位年龄35岁。临床诊断肺结核544例，非肺结核1 105例（非结核分枝杆菌病173例）。疑似肺结核患者纳入标准：咳嗽≥2周，发热或呼吸困难，有肺结核影像学特征，有效的痰液标本（大于3 ml）。排除标准：不能提供有效的痰标本，不能随访及失访者，胸部影像学无任何临床活动性肺结核表现。临床肺结核诊断标准参照最新版肺结核诊断标准（WS288-2017）[6]。本研究经医院伦理委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂GeneXpert MTB/RIF设备及配套试剂盒（Cartrige反应盒）、痰液处理试剂等购自美国Cepheid公司；BACTEC MGIT 960系统及其配套试剂（MGIT培养管、分枝杆菌培养添加剂、分枝杆菌药敏试剂盒）购自美国BD公司；涂片用抗酸染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.2.2 痰涂片镜检按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[7]要求完成标准化操作。

1.2.3 液体培养及药敏采用BACTEC MGIT 960系统，参照《结核病诊断实验室检验规程》[8]进行分枝杆菌培养及药敏检测的标准化操作。

1.2.4 GeneXpert MTB/RIF检测按照GeneXpert MTB/RIF操作说明书，移取1.0 ml痰液至螺纹盖试管中并加入2倍体积痰液处理液，漩涡振荡混匀10 s后静置15 min，用专用吸管转移样本至Cartrige反应盒后放入仪器样本舱进行DNA提取、PCR扩增及结果判定，通过专用软件判读结果。

1.2.5 质量控制检测涉及的各标本均严格按照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[9]要求进行处理。痰涂片镜检按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[7]实施了盲法复检及室内质控。液体培养及药敏每批次均分别接种了质控株H37Rv进行结果判定。GeneXpert MTB/RIF系统每个检测匣定期进行样品处理质量控制（SPC）和探针质量控制（PCC），确保检测系统合格。

1.3 统计方法采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计数资料采用检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同实验方法检测MTB阳性情况1 649例患者痰标本中，涂片镜检阳性361例（21.89%），阴性1 288例（78.11%）；液体培养法阳性717例（43.48%），阴性932例（56.52%）；GeneXpertMTB/RIF检出阳性614例（37.23%），阴性1 035例（62.77%）。717例液体培养阳性的痰标本中经菌种鉴定为MTB的544例，非结核分枝杆菌173例。361例涂片镜检为阳性的患者标本经GeneXpertMTB/RIF检测有357例阳性，1 288例涂片阴性的患者标本经GeneXpert MTB/RIF检测有257例阳性。544例液体培养法为阳性且菌种鉴定为结核的患者标本经GeneXpert MTB/RIF检测阳性484例，932例液体培养法阴性的患者标本经GeneXpert MTB/RIF检测阳性129例。以液体培养法为“金标准”，涂片法和GeneXpert MTB/RIF检测MTB的敏感性分别为65.26%和88.97%，差异有统计学意义（=86.67，P＜0.05）。特异性分别为99.46%和86.16%，差异有统计学意义（=123.63，P＜0.05）。一致性分别为86.86%和87.20%，差异无统计学意义（=0.08，P＞0.05）。

2.2 GeneXpert MTB/RIF检测涂阳及涂阴痰标本MTB阳性情况液体培养阳性及菌种鉴定为MTB的544例痰标本中，涂阴患者189例（GeneXpert MTB/RIF检出阳性129例），涂阳患者355例（GeneXpert MTB/RIF检出阳性355例）；液体培养阴性的932例痰标本中，涂阴患者927例（GeneXpert MTB/RIF检出阳性128例），涂阳患者5例（GeneXpert MTB/RIF检出阳性1例）。以液体培养结果为“金标准”，GeneXpertMTB/RIF检测涂阴痰标本中MTB的敏感性及特异性分别为68.25%和86.19%，检测涂阳痰标本中MTB的敏感性及特异性分别为100.00%和80.00%。GeneXpert MTB/RIF检测涂阳痰标本的敏感性高于涂阴痰标本（=126.67，P＜0.01）。GeneXpert MTB/RIF检测涂阳痰标本的特异性与涂阴痰标本差异无统计学意义（=0.16，P＞0.05）。

2.3 GeneXpert MTB/RIF检测利福平耐药性评价基于液体培养法药敏检测利福平耐药共34例，GeneXpertMTB/RIF检出利福平耐药34例，以液体培养法药敏检测结果为“金标准”，GeneXpert MTB/RIF对MTB利福平耐药性检测的敏感性和特异性分别为100.00%和97.16%。

3 讨论

病原学检测对结核病疫情的有效防控及临床化疗方案的合理制定具有重要意义。目前我国结核病诊断传统检测方法主要为涂片镜检和痰培养。涂片镜检敏感性及特异性较低，痰培养虽为结核病诊断的“金标准”，但由于耗时较长，限制了其在临床上的应用[10]。早期、快速及准确的检测MTB及其耐药性成为结核病防控中迫切需要解决的问题。作为WHO推荐的GeneXpert MTB/RIF技术已在多个国家和地区进行了验证评估，效果良好[11-12]。

本研究以液体培养法结果为“金标准”，比较了GeneXpert MTB/RIF和涂片镜检在痰标本MTB检测中的效能，结果显示GeneXpert MTB/RIF检测MTB的敏感性与特异性均远高于涂片镜检，与国内外研究报道相符[3-4,13-14]。同时和作为“金标准”的液体培养法相比，GeneXpert MTB/RIF检测MTB阳性率虽略低于液体培养法，但差异无统计学意义（P＞0.05），且GeneXpert MTB/RIF检测结果报告时间大幅缩短，这提示该技术对MTB的早期诊断具备更大的优势。

提高涂阴患者MTB的检出率有助于肺结核的早期诊治及疫情的有效控制[15]，但涂阴肺结核的诊断一直是临床工作中的重点和难点。有研究报道镜检涂片阳性至少每毫升痰液中需含5000～10000拷贝的抗酸杆菌[16]。本研究结果显示以液体培养法结果为“金标准”，GeneXpert MTB/RIF检测涂阳痰标本MTB的敏感性高于涂阴痰标本，这可能是由于涂阳痰标本含菌量更高，导致MTB更易被检测出。同时本研究结果显示1 116例涂阴痰标本经GeneXpert MTB/RIF检测后，检出阳性标本257份，检出阳性率为23.03%，这一现象可能与GeneXpert MTB/RIF技术本身具有更高的敏感性（每毫升痰液中含131拷贝即可检出）有关。这提示GeneXpert MTB/RIF可作为涂阴肺结核患者涂片镜检后有效的补充检测手段，以提高涂阴肺结核患者的病原学阳性率。

MTB利福平耐药性检测常被作为耐多药肺结核（MDR-TB）的监测指标。结核分枝杆菌利福平耐药主要分子机制为rpoB基因发生突变[17]。本研究结果显示以MGIT 960药敏试验结果为“金标准”，GeneXpert MTB/RIF对MTB利福平耐药性检测的敏感性、特异性及一致性均较高，且操作更简便，耗时更短。这提示GeneXpert MTB/RIF技术更适合于基层结核病实验室开展MTB利福平耐药性的测定。

临床上目前对NTM和MTB感染的鉴别主要还是依靠基于痰培养方法的菌型鉴定，耗时较长，准确性较低。本研究结果显示173例非结核分枝杆菌中，GeneXpert MTB/RIF检测结果为阴性的有172例（99.42%），这提示GeneXpert MTB/RIF对NTM感染的早期鉴别诊断具有重要的临床应用价值。

综上所述，基于快速、简便、敏感性及特异性强且生物安全要求不高等特点，GeneXpert MTB/RIF能更好的辅助于临床医生对MTB的早期发现及利福平耐药性的快速判定，从而为临床有效治疗肺结核及减少疫情传播提供技术支撑。