基于PCR的分子生物学技术在检测非结核分枝杆菌中的进展

张 娴，陈春宇，何 纲，甄沛林

非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM） 是分枝杆菌属内不包括结核分枝杆菌复合群（mycobacterium tuberculosis complex，MBTC） 和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌，到目前为止至少存在190 余种NTM[1]。Xu D 等[2]一项报告显示，在中国结核病疑似患者中，NTM 感染率从1.60 %（2004年～2009年）到3.13%（2012年～2017年），提示近年来NTM 的感染呈明显增加的趋势[3～8]。不仅如此，NTM病与结核病在临床症状和影像学表现上均十分相似，同时NTM 在痰标本涂片抗酸杆菌检查上可呈阳性，因此临床上NTM 病容易被误诊为结核病[9]。由于NTM 对临床上常用的抗结核药耐药[10，11]，因此及早识别出NTM的感染至关重要。然而传统检测NTM 的方法操作需要2～3 个月，操作复杂，无法满足临床的实际需求，亟待使用和推广新型的诊断技术。近年来随着以聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction，PCR）技术为基础的分子生物学技术不断发展，极大地促进了NTM 检测技术的进步。

PCR 技术基本原理是利用各种分枝杆菌特异的DNA 引物对待检的DNA 序列进行体外扩增，根据扩增的、特异的DNA 片段对分枝杆菌进行鉴定。PCR技术对实验室的环境要求较高，样品易被污染，产生假阳性或非特异性扩增的结果[12]。因此，在此基础上发展延伸的用于检测分枝杆菌的各项技术应运而生。笔者将对以PCR 技术为基础的分子诊断技术在NTM 检测中的进展进行系统综述。

1 基于聚合酶链式反应扩增产物的现代分子生物学技术

1.1 限制性片段长度多态性聚合酶链式反应技术

限制性片段长度多态性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术是选取分枝杆菌的一段特异的基因序列进行扩增，将扩增产物用限制性内切酶消化后再进行凝胶电泳分析，电泳产生不同的酶切指纹图谱，通过分析电泳图谱对分枝杆菌菌种进行鉴定。常用于PCR-RFLP 诊断分枝杆菌的靶基因序列有65 kDa 热休克蛋白编码基因（65-kDa heat shock protein gene，hsp65）、rpoB 基因 IS6110、16S -23S rRNA 基因内转录间隔区（internal trans scribed spacer，ITS）序列、16S rRNA 基因等[13]。Ong CS 等[14]分别使用PRA-hsp65 和PRA-rpoB 对90 株NTM 菌株进行鉴定，PRA-hsp65 鉴定出83 株菌株 （占92.2 %），PRA-rpoB 鉴定出78 株菌株（占86.7%）；对于47 种快生长非结核分枝杆菌（rapidly growing non-tuberculous mycobacteria，RGM） 菌种，PRA-hsp65 鉴定出的菌种数量（占89.4%）少于PRA-rpoB（占95.7%），但是对于23 种慢生长非结核分枝杆菌 （slowly growing non-tuberculous mycobacteria，SGM）菌种，PRA-hsp65可鉴定出91.3%，而PRA-rpoB 仅鉴定出52.5%，提示PRA-hsp65 比PRA-rpoB 在鉴定分枝杆菌菌种时鉴别准确度更高，特别是对SGM 的鉴定。Huang CC 等[15]一项研究分析376 株痰标本涂片抗酸杆菌检查阳性的分枝杆菌培养物，包括200 株MBTC 和176 株NTM。联合利用PRA-rpoB 和PRA-hsp65，鉴定MTBC 的准确率为100%（200 株菌株），鉴定NTM 的准确率为91.4%（161 株菌株）。该研究表明，联合利用PRArpoB 和PRA-hsp65 可提高NTM 检测的准确率。然而，PCR-RFLP 在用凝胶电泳进行分析时，很难区分大小几乎相同的条带，也不能对小于60 bps 的条带进行区分[16]。此外，由于缺少标准统一的操作方法，不同的操作方法也会造成不同的识别结果。

1.2 分子线性探针技术

最常用的直接探针杂交测定法是美国Gen-Probe 公司的Accuprobe 基因探针。Accuprobe 基因探针技术鉴定的菌种数量有限，仅可鉴定4 种分枝杆菌菌种和2 种分枝杆菌复合群，包括MBTC、鸟分枝杆菌复合群、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌，其可鉴定的NTM 菌种数量有限[17]。而新一代分子杂交技术是分子线性探针技术（Hain技术），可鉴定的菌种种类与直接探针杂交测定法相比明显增加。

分子线性探针技术是首先使用PCR 扩增目的基因片段，然后用固定在膜上的特异性探针与扩增产物杂交，最后通过判断显色反应的结果鉴定分枝杆菌菌种。现有的商业探针主要有3 种：比利时Innogenetics公司生产的INNO LiPA 试剂盒、德国Hain Lifescience公司生产的GenoType Mycobacterium CM/AS 试剂盒、西班牙Vincel 公司生产的Speed-Oligo Mycobacteria试剂盒。它们的靶基因序列分别位于16S-23S rRNA ITS、23S rRNA 基因、16S rRNA 基因和16S-23S rRNA ITS。其中GenoType Mycobacterium CM/AS 试剂盒最为常用。CM 试剂盒可识别以下分枝杆菌菌种：MBTC、鸟分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶发分枝杆菌、戈登分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、插入分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、海分枝杆菌/溃疡分枝杆菌、外来分枝杆菌、蟾分枝杆菌，而AS 试剂盒进行第二次杂交，对相对少见的NTM 的鉴定，包括猿分枝杆菌、黏液分枝杆菌、戈地分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、日内瓦分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、M.heckeshornense、苏尔加分枝杆菌、草分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、胃分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、下出分枝杆菌[18]。Lee AS 等[19]利用GenoType Mycobacterium CM/AS 试剂盒对131 株NTM 菌株和19 株对照菌株进行鉴定，对照菌株包括14 种分枝杆菌菌种和5 种其他菌种。GenoType Mycobacterium CM/AS 试剂盒正确的鉴定了131 株NTM 菌株中的119 株，占90.8%（119/131），其中GenoType 分枝杆菌CM 试纸正确鉴定出87 株，占66.4%（87/131），AS 条用于鉴定其余的44 株NTM 菌株，包括CM 试纸无法区分2个密切相关的菌种，包括海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、嗜血分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌。该研究表明GenoType Mycobacterium CM/AS 试剂盒具有快速、准确度较高、鉴定范围广、技术要求较低等优点。

1.3 荧光定量聚合酶链式反应熔解曲线法

荧光定量PCR 熔解曲线法的基本原理是在PCR扩增反应完成后，对PCR 产物进行加热，随着反应中双链DNA 逐渐解链，荧光信号逐渐降低，当加热的温度超过双链DNA 解链50%的温度（melting temperature，Tm）时，双链DNA 迅速解链，荧光信号骤降，形成荧光信号曲线上变化的拐点。对荧光信号曲线进行负一阶求导得到熔解曲线图，熔解曲线峰值对应的温度就是双链DNA 的Tm 值。厦门致善生物科技股份有限公司发布了MeltPro 分枝杆菌测定法[20]，该方法基于独特的多色探针溶解曲线分析技术及“荧光-熔点”二维标签技术，可在一个PCR 反应管内鉴别临床上常见的分枝杆菌，包括牛分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌/溃疡分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、结核分枝杆菌、猿分枝杆菌、缓黄分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、土地分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、蟾分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌，具有高通量、操作简单、闭管检测等优点。在临床检测中，荧光定量PCR 熔解曲线法存在一定的局限性：①标准曲线很容易受到各种因素的影响，如引物或探针设计不合理、引物之间或者引物与探针的比例不合适、Taq 酶的效率、荧光染料的浓度和PCR 产物片段的长度等；②部分标本中存在反应抑制剂，如血液抗凝剂、甲醛等，降低了扩增效率，影响Ct 值；③荧光定量PCR 熔解曲线法是相对定量的方式，因此在不同的模板浓度及低拷贝靶分子的条件下，其检测精确度、灵敏度均会受到影响，这也是当前荧光定量PCR 的最大缺陷。

1.4 聚合酶链式反应-基因测序法

DNA 测序被认为是鉴定NTM 菌种的“金标准”，主要是扩增分枝杆菌特异的DNA 序列后直接测序，与基因库对比得到鉴定结果，可将分枝杆菌鉴定至种或亚种水平，速度较快，分辨率较高，但费用高，难以在临床上推广使用。几种用于NTM 菌种鉴定的常见靶基因详述如下。

1.4.1 16S rRNA 基因

16S rRNA 基因约有1 500 个的核苷酸序列，5＇端序列大约有500 bps，在结构上高度保守，只有少量的核苷酸序列出现改变，这些改变的核苷酸序列含有分枝杆菌菌属或种的特异性，可将分枝杆菌鉴定至种甚至亚种水平，因此16S rRNA 基因测序广泛用于分枝杆菌菌种的鉴定[21]。16S rRNA 基因测序具有一定的局限性，无法对具有相同高可变区的分枝杆菌或16S rRNA 基因相同的分枝杆菌进行鉴别，比如脓肿分枝杆菌与龟分枝杆菌[21，22]。

1.4.2 65 kDa 热休克蛋白编码基因

hsp65 主要通过使用441 bp 大小的hsp65 基因片段来区分密切相关的NTM 菌种[22]。hsp65 在分枝杆菌中的保守性比16S rRNA 基因序列低，因此鉴定菌种的准确度更高，比如可鉴别16S rRNA 基因序列无法鉴别的脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌等某些NTM[22]。然而，目前没有用于比较序列结果的标准化数据库，只有网络数据库。网络数据库提供的有关hsp65 基因序列的信息不仅可能存在信息不全的问题，还可能出现错误，造成错误的鉴定结果。

1.4.3 rpoB 基因

PCR-基因测序法一般扩增rpoB 基因360 bp 片段来鉴别分枝杆菌，与16S rRNA 基因相比，rpoB 基因序列足够小，可以直接在两个方向同时进行测序，且包含足够的信息来区分目前已知的大多数分枝杆菌[22]。此外，rpoB 基因序列不仅能识别常见的NTM 菌种及区分部分16S rRNA 基因无法区分的分枝杆菌[21]，还能识别更多罕见的NTM 菌种，因此rpoB 基因测序推荐和16S rRNA 基因测序联合使用，以提高对NTM菌种鉴定的辨别能力。

1.4.4 其他的同源序列

除了上述3 个基因序列以外，还有其他常见的同源基因序列，如Erm、DnaJ、see A1 等。Erm（41）通常存在于脓肿分枝杆菌脓肿亚种及脓肿分枝杆菌博莱亚种中，可将脓肿分枝杆菌鉴定至亚种水平[23，24]。

2 在常规聚合酶链式反应基础上改进的新型聚合酶链式反应扩增技术

2.1 巢式聚合酶链式反应技术

巢式PCR 是通过两轮PCR 反应，使用两套引物扩增特异性的DNA 片段，因此巢式PCR 的扩增非常具有特异性。Wu TL 等[25]开发出一种新的NTM 测定方法：巢式PCR 限制性片段长度多态性分析（nested PCR-restriction fragment length polymorphism analysis，nested-PRA）。该研究把以hsp65 为靶基因的nested-PRA 与传统的培养方法及16S rRNA 基因测序鉴定比较，分析204 份涂片阳性和培养阳性的痰标本，这些痰标本根据抗酸杆菌（acid-fast bacillus，AFB）染色等级分为稀少/1+、2+或3+。nested-PRA 的检测表明，AFB 3+、AFB 2+和AFB 1+样品的识别率分别为100%，95%和53%，总体识别率为89%，且nested-PRA 得到的菌种鉴定结果与培养和16S rRNA 基因测序的结果一致，提示nested-PRA 的诊断效能较高，在结核病高度流行的地区，此方法具有极大的临床应用价值。

2.2 多重聚合酶链式反应技术

多重PCR 是在同一PCR 反应体系中加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR 反应。韩国Kim MJ 等[26]研发了两步九重PCR 检测方法，在第1 步的九重PCR 检测鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，第2 步的九重PCR 检测堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和M.massiliense，该研究将两步九重PCR 和基于多基因序列分析来鉴定320 个临床样本中的NTM 菌株，两步九重PCR 检测方法可鉴定超过95%的NTM 菌株[26]。Kim MJ 等[27]开发了一种五重实时荧光定量PCR 检测，该方法可检测20 种分枝杆菌，包括MBTC、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、外来分枝杆菌、胃分枝杆菌、戈登分枝杆菌、土地分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、脓毒性分枝杆菌、黏液分枝杆菌、隐藏分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、蟾分枝杆菌、海分枝杆菌/溃疡分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌，并对来自1 437 例疑似结核感染患者的3 334 个临床样本进行五重实时荧光定量PCR 检测。研究结果显示，五重实时荧光定量PCR 检测MBTC的临床样本的灵敏度、特异度分别为87.5%、99.6%，检测NTM 的临床样本的灵敏度、特异度分别为53.3%、99.9%。表明多重PCR 在鉴别MBTC 和NTM 的特异度高，具有明显的优势；尽管多重PCR 对NTM 病的诊断灵敏度有限，但仍可作为一项快速区分结核病和NTM 病的检测技术。

3 快速检测标本、无需扩增后鉴定产物的新型PCR 技术

3.1 荧光定量聚合酶链式反应技术

第2 代PCR 技术实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantify polymerase chain reaction，real-time FQ-PCR）技术是把荧光基团加入PCR反应体系中，通过荧光信号的积累来实时监测PCR的进程，进而得到标准曲线，模板DNA 可根据标准曲线来进行定量分析，避免扩增后进行复杂的定量检测工作。韩国Jung YJ 等[28]一项前瞻性研究对100 个临床样本使用常规PCR 检测和3 种实时PCR 检测（AdvanSure 试剂盒、Genedia 试剂盒、Real-Q 试剂盒）分析了85 种类型菌株和100 份分枝杆菌培养基的培养产物，菌株的准确率分别为89.4%、100.0%、98.8%和98.8%，PCR 检测的总体灵敏度都高于95%，3 种real-time FQ-PCR 检测在区分分枝杆菌菌种和非分枝杆菌属物种方面均比传统PCR 检测具有更好的特异度。Real-time FQ-PCR 不仅具有特异性强、灵敏度高的优点，而且real-time FQ-PCR 基因扩增和产物分析可在一个反应管内进行，扩增和检测一步完成，不用开盖，减少核酸被污染的风险，不需要后期处理，操作简单、安全、无污染。

3.2 数字聚合酶链式反应技术

数字聚合酶链式反应 （digital polymerase chain reaction，dPCR） 技术是基于传统PCR、real-time FQPCR 基础上发展起来的第3 代PCR 技术，通过结合泊松分布统计和有限稀释对DNA 分子进行量化，实现精确的绝对定量检测。dPCR 的技术原理是把单个DNA 分子置于独立的反应室中进行PCR 扩增，利用TaqMan 探针法或染料法检测特定的靶序列[29]。相比于前两代PCR 技术，dPCR 是单分子扩增技术，可以提供样本细菌数量的直接计数，提高检测的灵敏度；同时，随着反应室的增加，反应受到抑制剂的影响就越小；此外，dPCR 无需制作标准曲线，即可实现更灵敏、更精确的绝对定量。宋能等[30]使用dPCR 检测到26 例结核病患者血液中的CFP10 DNA 或Rv1768 DNA，结果表明使用dPCR 的灵敏度、特异度和检出率均为100%，使用real-time FQ-PCR 的灵敏度、特异度和检出率分别为65%、100%和65%，对于痰标本涂片抗酸杆菌检查和痰培养，灵敏度分别仅为23%和58%，表明dPCR 比real-time FQ-PCR、痰标本涂片抗酸杆菌检查和痰培养对TB 诊断具有更高的灵敏度。不仅如此，该研究[30]还显示CFP10 DNA 的检测限值对于dPCR 为1.2 cp/μL，而对于real-time FQPCR 为15.8 cp/μL，提示dPCR 与real-time FQ-PCR相比还可以更准确地检测血液中的极少量的核酸[31]。

dPCR 作为一项新型的PCR 核酸检测技术，具有准确度高、灵敏度高、绝对定量等优点，在临床检验具有明显的优势，但目前利用dPCR 技术检测NTM 的研究鲜有报道，值得进一步探讨和研究。

4 结语

近年来，随着PCR 技术的不断发展，涌现出一批新的分枝杆菌菌种鉴定的新技术，如PCR-基因测序、线性探针、dPCR 等技术，与传统的NTM 培养等技术相比，具有快速、操作简便、鉴定准确等优势。基于PCR 的现代分子生物学技术在NTM 菌种鉴定方面具有巨大的应用前景，相信在未来将更加完善这些鉴定方法，给临床治疗提供指导。