响应面法优化槲蕨总黄酮提取工艺及其抗氧化活性

段小华,罗时静,王伟琪,邓荣根,鲁顺保

(江西师范大学生命科学学院,江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室,江西 南昌 330022)

0 引言

槲蕨(DrynariaroosiiNakaike)属于槲蕨科(Drynariaceae)槲蕨属(Drynaria)植物[1],主要分布于中国南方城市，为多年生附生蕨类，通常附生于岩石壁、墙壁或树干上[2].在《中国药典》中记载，槲蕨的根状茎“骨碎补”常被作为中药材使用，具有疗伤止痛、补肾强骨等功效，外用还能消风祛斑[3].现代研究表明:槲蕨根茎具有修复牙周组织[4]、治疗骨质疏松[5]、活血化瘀[6]、强心、镇痛镇静[7]、抗炎、抗氧化[8]和抗过敏[9]等药理作用.槲蕨根状茎所含的化学成分包括黄酮类、三萜类、木质素、苯丙素类等化合物[10-11],但其药理作用的主要活性物质是黄酮类化合物.黄酮类化合物具有抗炎、抗菌抑菌、抗癌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、降血脂、降血清胆固醇、治疗心血管疾病等多种生物活性功能[12-15].因此,槲蕨总黄酮的提取及其活性研究受到研究者的普遍关注[16-17].

传统提取总黄酮的方法有乙醇浸提法、水煎煮法、水浸提法等[17],此类方法虽然经济节约，但是耗时较长.超声波提取法具有设备简单、操作方便、提取时间短、提取率高等优点[18],是目前提取天然植物有效成分常用的方法.响应面法(response surface methodology,RSM)是一种较优且应用较广的实验优化方法.目前,有关槲蕨总黄酮超声波提取工艺优化大多数采用正交实验法[19-20].李景等[21]对槲蕨总黄酮的超声波提取工艺进行了响应面优化,但他们没有考虑超声波功率这个重要的因子.为完善槲蕨总黄酮的提取工艺,本文采用超声波辅助乙醇提取，结合响应面法来进一步优化槲蕨总黄酮的提取工艺,并探究了槲蕨总黄酮的抗氧化作用,为充分利用槲蕨资源、进一步研究其药理活性提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槲蕨来源于市售,于80 ℃恒温箱中烘干至恒质量，粉碎后过60目筛，将干燥样品粉末置于4 ℃冰箱中保存备用.

芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所；DPPH购自上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氯化钠、水杨酸、30%H2O2溶液、九水合硝酸铝、硫酸亚铁、抗坏血酸、Tris、盐酸、邻苯三酚等均为分析纯试剂.

1.2 实验仪器

实验仪器主要有:DHG-9070型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司),JYS-M01九阳磨粉机(九阳股份有限公司),JA5003N电子天平(上海精密科学仪器有限公司),KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂),759S紫外-可见分光光度计(上海棱光技术有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 槲蕨总黄酮的提取工艺流程 槲蕨根→60 ℃烘干至恒质量→粉碎→过60目筛→精确称取1 g槲蕨根粉末→按一定料液比添加提取剂于常温下浸泡24 h→超声波辅助提取→减压抽滤→收集滤液→定容→取样测定→计算总黄酮产率.

1.3.2 槲蕨总黄酮产率的测定 参照杨斌等[22]和许远等[23]的方法测定样品中槲蕨总黄酮含量，并计算总黄酮产率.

1.3.3 单因素实验 采用超声波辅助乙醇法提取槲蕨总黄酮，在其他条件相同的情况下，各单因素变量分别设置为:乙醇体积分数为35%、45%、55%、65%、75%、85%,超声功率为300、350、400、450、500 W,超声时间为15、30、45、60、75 min,料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g·mL-1,分析各因素对槲蕨总黄酮产率的影响.

1.3.4 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，选取料液比(A)、超声功率(B)、乙醇体积分数(C)3个因素为自变量，槲蕨总黄酮产率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件依据Box-Behnken中心组合设计原理，设计3因素3水平的响应面实验优化槲蕨总黄酮的提取工艺，各因素水平如表1所示.

1.3.6 数据统计分析 采用Microsoft Excel 2016软件对单因素实验数据和抗氧化活性实验数据进行数据分析和绘图,用Design-Expert 8.0.6软件对响应面优化实验设计进行分析以及对响应面实验数据进行分析和绘图(n=3).

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对槲蕨总黄酮产率的影响 料液比对槲蕨总黄酮产率的影响如图1(a)所示.由图1(a)可知:槲蕨总黄酮产率随着料液比的增大先呈上升趋势；当料液比为1∶30(g·mL-1)时，总黄酮产率达到最高值，然后随着料液比继续增大，总黄酮的产率呈下降趋势.其原因可能是:随着料液比的增大，槲蕨根茎粉末在溶液中的分散程度增大[26],接触面积也越来越大，总黄酮产率提高.但当料液比超过1∶30(g·mL-1)时，黄酮的溶出已达到极限，可能还有其他物质溶出，影响了槲蕨总黄酮的提取效果，导致其产率下降[27].因此，本文选取料液比为1∶25～1∶35(g·mL-1)进行响应面实验.

2.1.2 超声功率对槲蕨总黄酮产率的影响 超声功率对槲蕨总黄酮产率的影响如图1(b)所示.由图1(b)可知:在超声功率≤450 W时,槲蕨总黄酮产率随着超声强度的增大而提高;当超声功率达到450 W时，槲蕨总黄酮产率达到最大值;当超声功率>450 W时，槲蕨总黄酮产率随超声功率的增大而减小.其原因可能是:超声波功率越大，超声波所产生的破碎效应和空化效应越明显，对细胞壁的破坏作用也越大，这有利于黄酮的加速溶出[28].但若超声强度过大，则会破坏黄酮物质的结构，从而使总黄酮的产率降低[29].因此，本文选取超声功率为400～500 W进行响应面实验.

2.1.3 乙醇体积分数对提取的影响 乙醇体积分数对槲蕨总黄酮产率的影响如图1(c)所示.由图1(c)可知:槲蕨总黄酮产率开始随着乙醇体积分数的增加而增加.当乙醇的体积分数为65%时，总黄酮产率达到最大值,然后随着乙醇体积分数继续增加，总黄酮产率反而下降.其原因可能是:黄酮与乙醇极性相近，随着乙醇体积分数的增加，黄酮的溶出也增多，从而使其产率增加[28].当乙醇的体积分数过高时，一些醇溶性杂质、脂溶性杂质和色素等成分大量溶出[30],影响黄酮的溶出，从而使槲蕨总黄酮产率下降.因此，本文选取乙醇体积分数为55%～75%进行响应面实验.

2.1.4 超声时间对提取的影响 超声时间对槲蕨总黄酮产率的影响如图1(d)所示.由图1(d)可知:在15～30 min内，槲蕨总黄酮产率随着超声提取时间的增加而提高;在30～45 min内，总黄酮产率下降;当超声时间>45 min时,总黄酮产率随超声时间延长而提升.其原因可能是:在提取之初，随着超声时间增加，总黄酮逐渐溶于乙醇提取液，产率逐渐增加，但在到达一定时间后，原料内外黄酮质量浓度达到相对平衡状态[31]，在样品内的黄酮不易被继续溶出，同时有些骨碎补黄酮类化合物成分的结构被破坏，从而导致产率有所减少.然后随着超声时间的延长，超声波的机械震动和空化作用持续加强，导致槲蕨细胞破碎程度增大，总黄酮的溶出又继续增加，从而使黄酮的产率增加[32].考虑到超声提取时间越长，能耗和经济成本越大.因此,本文在响应面实验中将超声波提取时间定为30 min，且不作为响应面考察因素.

图1 料液比、超声功率、乙醇体积分数、超声时间对桷蕨总黄酮产率的影响

2.2 响应面结果与分析

根据响应面实验设计方案，在单因素实验基础上，以料液比、超声功率和乙醇体积分数为考察因素，以总黄酮产率为响应值进行响应面实验，实验设计及结果如表2所示.

表2 Box-Behnken实验设计与结果

采用Design-expert8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合，得到槲蕨总黄酮产率(Y)与超声辅助各因素变量间的回归方程:

Y=1.43+0.028A+0.029B+0.029C-5.061×10-3AB-2.956×10-3AC+8.124×10-4BC-0.062A2-0.22B2-0.038C2.

对回归模型进一步进行方差分析，结果如表3所示.由表3可知:模型的P<0.000 1说明回归模型方程极显著;失拟项的P=0.582 7>0.05(不显著),这说明回归方程与实验拟合较好.相关系数R2=0.974 5、调整系数R调=0.941 8,这表明模型拟合较好;CV=2.47%表明实验的可信度和精确度较高.根据回归方程各项分析可知:回归模型1次项A、B、C和平方项C2为模型显著因素，平方项A2和B2为模型极显著因素，其他各因素对槲蕨总黄酮产率的影响均不显著.各因素对槲蕨总黄酮产率的影响作用大小依次为C>B>A.

表3 响应面方差分析

各因素交互作用对槲蕨总黄酮产率影响的响应面结果如图2所示.响应面图和等高线图能够将回归模型直观生动地表现出来:3D响应面图形状越陡峭、2维等高线越趋近于椭圆形表明2因素交互作用越显著；若响应曲面坡度平缓、等高线趋近于圆形，则2因素交互作用对响应值的影响较小[33-34].由图2可知:超声功率和料液比、乙醇体积分数和料液比、乙醇体积分数和超声功率这3组交互作用的响应曲面图都较为平缓，它们对槲蕨总黄酮产率的影响均不显著.该结果与模型方差分析结果一致.

图2 各因素交互作用的响应面图

根据回归模型预测槲蕨总黄酮提取的最佳工艺条件为料液比1∶31.08(g·mL-1)、超声功率453.22 W、乙醇体积分数68.84%，在该条件下槲蕨总黄酮的产率为1.435%.结合试验实际情况，将最优提取工艺参数调整为料液比1∶30.00(g·mL-1)、超声功率450.00 W、乙醇体积分数68.00%，在该条件下进行3次平行试验验证，取平均值，得到槲蕨总黄酮的产率为1.452%，与预测值接近.这说明该模型能较好地反映槲蕨总黄酮的提取条件，与实际情况拟合较好.

2.3 槲蕨总黄酮抗氧化性分析

2.3.1 槲蕨总黄酮对DPPH·清除能力 不同质量浓度的槲蕨总黄酮对DPPH·清除能力如图3所示.从图3可知:槲蕨总黄酮对DPPH·的清除率随槲蕨总黄酮质量浓度的增加而增大，具有较好的量效关系.当槲蕨总黄酮质量浓度为0.066 mg·mL-1时，对DPPH·的清除率为65.74%.维生素C对DPPH·清除率的变化趋势与槲蕨总黄酮的相似，但在相同质量浓度的条件下，槲蕨总黄酮对DPPH·的清除能力均显著低于维生素C对DPPH·的清除能力.

图3 桷蕨总黄酮和维生素C对DPPH·的清除能力

2.3.2 槲蕨总黄酮对·OH清除能力 不同质量浓度槲蕨总黄酮对·OH的清除能力如图4所示.从图4可以看出:在低质量浓度时，槲蕨总黄酮对·OH的清除率增长较慢;当槲蕨总黄酮质量浓度达到0.016 5 mg·mL-1时，对·OH的清除率随着浓度的增加而显著增强;当槲蕨总黄酮质量浓度为0.066 0 mg·mL-1时,其对·OH的清除率达到68.27%.维生素C对·OH的清除率随着质量浓度的增加而增加，在相同质量浓度的条件下，槲蕨总黄酮对·OH的清除能力均低于维生素C对·OH的清除能力.

图4 桷蕨总黄酮和维生素C对·OH的清除能力

图5 桷蕨总黄酮和维生素C对的清除能力

3 结论