基于代谢组学的中医药防治脑卒中的研究进展

马春玉，于子乔，王新娜，牛 萍，刘立明，刘 璐，于俊超，赵德喜

(1. 长春中医药大学，吉林 长春 130117；2. 长春中医药大学附属医院，吉林 长春 130021)

脑卒中是世界范围的公共卫生问题，据世界卫生组织报道，脑卒中位列全球死亡原因的第2位，卒中致死人数占总死亡人数的11.9%[1]。作为人口大国，我国的形势更为严峻，脑卒中居人群死亡原因首位，占年总死亡人数的1/5(约160万人/年)，其中缺血性脑卒中占脑卒中发病人数的70%～80%[2-3]。中医在《内经》时代就对本病有了实际的观察和理论层面的阐述，后世医书中也不乏对这一疾病的记载，可见本病是伴随着人类历史发展进程的，医学家们对本病的诊治也一直探索着。代谢组学(metabolomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后发展起来的一门新兴科学，它通过定性和定量分析生物样本中小分子代谢物组学的方法来观察生物体受到刺激后内源性代谢物变化和代谢通路及途径，以寻找代谢物与生理病理变化之间的相对关系，并利用液质联用/气质联用技术，反映其在某一时刻样本内所有代谢物及代谢动态规律[4-6]。代谢组学放大了基因和蛋白表达的微小变化，反映了机体系统的生理和病理状态，近年来在中医药防治疾病方面取得了很大的进展。现将近10年基于代谢组学的中医药防治脑卒中的研究作如下综述。

1 中医学对脑卒中的认识及治疗优势

脑卒中与中医学中的“中风”一名相对应。《内经》中有与本病表现相关的症状记载，如意识不清者称为“薄厥”，偏侧肢体活动不利者称为“偏枯”“偏风”，“瘖”则表示言语謇涩者。汉代张仲景所著的《金匮要略》中首见“中风”之名。由于各代医家所处历史阶段不同，临床实践经验各异，他们对于中风病致病因素、病理性质、病因、病机关键的阐述不尽相同。在唐宋以前，以张仲景提出的“内虚邪中”论为例，本病主要以“外风”立论。到宋末元初逐渐发展为以“内风”学说为主，并出现了以朱丹溪的“湿痰生热”论等为代表的病因病机学说。陈言对于中风病进行了较为细致的临床症状观察，并总结了本病的发病特点——喉中痰鸣、病发前眩晕、病情进展速度快等，使得后世医家更加意识到了预防本病的重要性。张子和在《儒门事亲·风论》中述：“风，有善行而数变，风之为致病皆生仓卒之变，致人言语謇涩、行动不利”。至明清及近代，则以“内伤积损”“肝阳化风”“气虚血瘀”“肝阳化风，气血并迸，直冲犯脑”等病机学说为代表。

吕健等[7]对临床常见的中药注射剂的研究颇为深入，课题组对灯盏细辛注射液治疗缺血性脑卒中进行了系统评价，结果显示：西药+灯盏细辛注射液的有效性、安全性均优于单纯西药治疗(P<0.000 01)。杨云芳等[8]采用随机的方法将986例符合纳入标准的缺血性卒中急性期患者进行分组，每组493例，治疗组在观察组西医治疗的基础上，给予中医非药物治疗(穴位敷贴、中药熏洗等)，结果显示：治疗组加用中医非药物治疗的总有效率高于观察组的西医治疗，体现出中医非药物疗法在脑卒中急性期患者治疗中的价值。以上结果均表明，中医药对在脑卒中的治疗中具有优势。

2 代谢组学对脑卒中的认识

代谢组(metabolome)是基因组的下游产物，也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常生长和发育功能的小分子化合物的集合。代谢组学是通过考察细胞、组织等生物体系受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。一般包括非靶向代谢组学、靶向代谢组学和脂质代谢组学。

2.1预防与诊断 在已确定的脑卒中危险因素中，血脂异常和糖尿病等疾病均以代谢变化为特征；代谢产物体积较小，更容易穿过血脑屏障；代谢产物相比于蛋白质，能更早地反映疾病的发生。因此，在评估脑卒中风险时，直接定量代谢物水平可能是一种优于传统基于危险因素分类的方法[9]。应用代谢组学的方法研究脑卒中的代谢产物水平及靶点可以为预防与诊断本病提供参考。Adnan等[10]进行了一项前瞻性队列研究，通过对比健康对照组和脑卒中风险组之间的不同代谢产物，以分析发生脑卒中之前血液的病理生理学变化。研究使用非靶向代谢组学得到了能够区分两组的氨基酸。此外，靶向代谢组学方法证实，定量的L-色氨酸、3-甲氧基酪胺、甲硫氨酸、高半胱氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、肉碱、精氨酸、亚油酸和鞘氨醇这些产物在后来被诊断出脑卒中的患者血清中异常升高。这些化合物可以作为早期诊断脑卒中的新型生物标志物。

Sun等[11]采用非靶向血清代谢组学的方法进行了一项寻找脑卒中生物标志物的前瞻性研究，对114例脑卒中患者和112例健康对照样本的研究结果表明，与细胞内十六烷二酸合成相关的通路参与了脑卒中的发生。Hu等[12]对招募的129名脑梗死和73名脑出血患者，以及98名健康对照者进行了血液样品的代谢组学分析。与健康对照组相比，脑梗死和脑出血患者分别显示出明显的代谢物变化，如在脑梗死组的Tyr、C5-OH/C0、Cit、Asn、Pro、Val、Arg/Orn、Leu和Val/Phe水平明显升高。Yun等[13]应用代谢组学研究大鼠局灶性脑缺血/再灌注(I/R)损伤早期的生化变化。研究结果表明，缺血大鼠脑脊液中的潜在生物标志物有乙酸、3-羟基异戊酸、3-羟基丁酸、胆碱、L-丙氨酸、肌酸、肌酐、甘氨酸、丙酮酸、甘油、谷氨酸、d-果糖、L-乳酸和丙酮。这些发现有助于我们了解局灶性脑缺血/再灌注损伤早期大鼠脑脊液中的生化代谢物变化。张春兵等[14]为探讨脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织和血清中的差异表达代谢物采用Zea Longa改良栓线法构建大鼠脑中动脉栓塞(MCAO)模型，收集脑组织和血清，采用气相色谱-质谱(GC-MS)方法检测代谢物表达谱。研究共鉴定出105个血清代谢物以及95个脑组织代谢物，与假手术组相比，MCAO组大鼠血清中尿素、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘露糖、尿素、苯丙氨酸以及蛋氨酸代谢物水平显著升高(P<0.05)，脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、肌醇、丝氨酸、丙三醇、亚油酸以及4-羟基脯氨酸水平显著降低(P<0.05)，MCAO模型大鼠脑组织丙氨酸、乳酸、尿素、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、2-羟基异丁酸、异亮氨酸水平显著升高(P<0.05)。代谢通路分析结果表明，这些差异代谢物可参与部分氨基酸合成及亚油酸代谢通路、甲烷代谢通路、甘油酯类代谢通路及氨酰-tRNA生物合成等，脑缺血再灌注损伤时脑组织与血清中存在的差异表达代谢物，可能参与脑卒中发病机制。以上结论突出了代谢组学在发现新的中风生物标志物方面的潜力，证明了靶向、非靶向代谢组学分析可能是诊断脑卒中的有效工具，值得进一步推广研究。

代谢组学的方法也应用于对卒中亚型诊断的研究中。Nelson等[15]采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS)检测367例急性脑卒中患者发病9 h内血浆中144种代谢产物，将181例心源性卒中与186例非心源性卒中患者进行比较。研究发现了琥珀酸与心源性卒中及卒中复发有关，揭示了心源性卒中与能量代谢之间的潜在联系。

2.2发病机制 脑卒中发病机制与能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用、活性氧失衡等代谢紊乱密切相关，而代谢组学可明确生物体不同代谢产物与相应生理、病理状态的关系。因此运用代谢组学分析不同样本代谢物的变化，对揭示脑卒中的发病机制有着至关重要的意义。黄玉等[16]采用基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF MS)的代谢组学方法，分析了缺血性脑卒中的生物标志物。实验收集30例缺血性脑卒中患者和17例健康志愿者的血浆样品，采用主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，研究了2组血浆中的代谢物差异，并进行了代谢通路分析。结果表明，患者组血浆中的二氢神经鞘氨醇、植物鞘氨醇等物质含量升高，谷氨酰胺、焦谷氨酸和2-酮丁酸等物质含量降低，即脑卒中不仅影响了鞘脂类和氨基酸的代谢，还对能量代谢产生了显著的影响。Zhang等[17]使用UPLC/Q-TOF MS对脑出血患者进行非靶向代谢组学分析，以探讨脑出血的可能机制。共有30名脑出血患者和30名对照受试者参加了该研究。结果共确定了脑出血患者11种与对照组相比不同的代谢物，它们与脂肪酸氧化、鞘脂和磷脂代谢的破坏以及炎症、氧化应激和血管病变的增加有关。对这些代谢物的进一步多元logistic回归分析表明，左旋肉碱和磷脂酰胆碱具有作为脑出血生物标志物的潜力。这为脑出血发病机制的研究提供了参考。

2.3脑保护机制 有研究表明，中药提取物可针对脑缺血性损伤提供直接保护并充当潜在的神经保护剂[18]。代谢组学可综合分析生物样品中的内源性小分子，通过多元统计分析机体受到刺激或者干扰后内源性代谢物的整体变化，是中医药与现代医学相结合的有力工具，对中医药治疗疾病机制的研究具有很大的潜力。应用代谢组学的方法研究中药对脑卒中的保护机制可能是一个可靠的方法[19]。

Wang等[20]通过基于GC-MS的代谢组学研究了临床上常用来治疗缺血性脑卒中恢复期的神经保护剂蒺藜果实总皂苷(GSTTF)对MCAO大鼠模型的保护作用。代谢组学分析显示，GSTTF可以通过调节包括脂肪酸代谢、氨基酸代谢和碳水化合物代谢在内的多种代谢途径来逆转MCAO引起的血清代谢偏差，起到神经保护作用。

丹参-冰片复方已广泛用于治疗缺血性脑卒中。丹酚酸B(Sal B)是丹参中含量及生物活性最高的化合物。然而，Sal B-冰片复方的科学内涵和配伍机制尚不清楚。Duan等[21]基于UPLC-Q/TOF-MS结合病理学的代谢组学方法，研究Sal B/冰片对抗MCAO大鼠的缺血性脑卒中。代谢组学结果分析表明，Sal B可以通过改善能量代谢、脂质代谢、炎症反应和氧化应激来改善MCAO诱导的脑缺血；冰片神经保护作用的增强与Sal B浓度的提高有关。这些发现初步阐明了Sal B或Sal B/冰片治疗缺血性脑卒中的神经保护作用机制，可推动丹参-冰片复方的二次开发。

3 基于代谢组学对中医药治疗缺血性脑卒中的研究

利用代谢组学的方法研究中医药，能够揭示疾病发病机制、复方及中医非药物疗法等治疗疾病过程中生物体系内所发生的代谢物及代谢通路的变化，即从中医“整体观念”的角度和中医药多组分、多靶点的特点出发研究生物体的功能水平，具有广阔的应用前景。

丹参川芎嗪注射液(DSCXQ)是一种常用于治疗脑卒中及其相关后遗症的中药制剂。目前对于DSCXQ对缺血性脑卒中起到保护作用的机制缺乏系统研究。Zhou等[22]基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的代谢组学分析DSCXQ治疗MCAO诱导的缺血性脑卒中的潜在机制。通过代谢组学分析，DSCXQ组和模型组之间鉴定出55种差异代谢物，涉及鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、初级胆汁酸、泛酸、CoA、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径。这项研究有助于我们了解缺血性脑卒中的代谢变化以及与DSCXQ临床应用相关的潜在机制。

徐敉等[23]采用代谢组学检测技术评价血府逐瘀汤对缺血性脑卒中大鼠的保护作用并探究其机制。采用线栓法建立缺血性脑卒中大鼠模型。灌药2周后采用UPLCQTOF-MS/MS法检测各组大鼠血清代谢谱的变化情况，用主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析，对检测结果作多元变量统计分析，筛选差异代谢物，并作代谢通路分析。结果显示，血府逐瘀汤对缺血性脑卒中保护作用的代谢途径主要有氨基酸代谢(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和色氨酸代谢)、鞘磷脂代谢和丁酸代谢等，即血府逐瘀汤液对缺血性脑卒中大鼠的治疗作用与氨基酸代谢和脂代谢有关。

补阳还五汤是一种临床上常用于帮助脑卒中后神经功能恢复的方剂。为了寻找补阳还五汤在中风治疗和预后中疗效的潜在临床指标，夏鑫华等[24]利用代谢组学技术探讨其干预缺血性脑卒中的作用机制。结果显示，与模型组比较，补阳还五汤组的内源性代谢物质谷氨酰胺、异亮氨酸、次黄嘌呤、前列腺素2、谷氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、缬氨酸、胆固醇和吲哚丙酸在模型组、假手术组、补阳还五汤组中变化显著，为缺血性脑卒中的潜在生物标志物，即补阳还五汤对局灶性脑缺血模型的神经保护作用机制可能与调节内源性代谢物变化有关。

黄连解毒汤(HLJDD)是经典的解热毒方剂。该方中黄芩、栀子等具有多种神经保护作用，已被广泛用于治疗脑卒中等神经系统疾病。Zhang等[25]研究了HLJDD的主要成分小檗碱(A)、黄芩苷(B)和茉莉花苷(C)的各种组合对大鼠MCAO模型的治疗效果。使用基于质子核磁共振(1H NMR)的代谢组学，对A、B和C单独及其组合的作用机制进行了研究。结果表明，ABC联合治疗提高了细胞抗氧化水平，这些抗氧化剂在缺血再灌注期间通过Nrf2信号级联反应清除活性氧，使用其他处理则未观察到这些保护作用。以上结果表明HLJDD中的成分组合比单味草药表现出更强的效果，也说明代谢组学方法是一种探索中药复方机制的有效工具。

脑脊液(CSF)中的氨基酸(AA)在脑缺血(CI)中起关键作用。步长脑心通胶囊(BNC)广泛用于治疗心脑血管疾病。为从系统层面探讨BNC逆转CI的治疗效果和药理机制，Xu等[26]首次构建了含有AA代谢物、关键调控酶和蛋白质的CI氨基酸-蛋白质相互作用失衡网络。该研究基于MCAO大鼠模型，分析了MCAO后3,6,12和24 h脑脊液中氨基酸的动态水平。基于CI的不平衡网络，选择并使用酶联免疫吸附测定和蛋白质印迹法验证了调节BNC介导AA生物标志物生成的四种关键酶，最后发现芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)是BNC起到神经保护作用的靶点之一。本研究为探索脑缺血的机制研究提供了新的策略，并有助于发现BNC的潜在作用机制。

4 小结与展望

中医药在防治脑卒中方面具有独特优势，且随着现代中医的发展，干预方法逐渐丰富，基础研究日渐深入。对于中药干预原本因出血或缺血产生紊乱的代谢产物的研究，需要通过对代谢产物的定量分析，为其病因病机和中药疗效提供物质解释[6]。

目前，代谢组学已在中医药与脑卒中之间架起了一座坚实的桥梁。然而，代谢组学在中医药方面的研究仍有很大的发展空间。首先，需要更新代谢组学技术，探索更为精准的靶点，以对脑卒中的诊断及用药有更精确的把握；其次，目前有关代谢组学在脑卒中治疗中的应用主要集中在实验性研究，相关的特异性生物学标志物存在与临床结合不够深入、研究数量不足、机制阐述不够全面等诸多问题，这些都是未来代谢组学技术的重点研究方向。想要在代谢组的基础上对脑卒中甚至于整个脑病系统的研究有更好的发展，除了代谢组学本身的进步外，还要求研究者运用这一技术对脑卒中进行全方位的研究，充分发挥代谢组学的优势，使中医药更好地服务于人类健康事业。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。