吲哚美辛通过NOS3影响线粒体呼吸链对非小细胞肺癌的机制

尚磊晶，孙盈盈，李元海

(1.安徽理工大学附属淮南新华医院麻醉科，安徽 淮南 232052；2.安徽省儿童医院麻醉科，安徽 合肥 230022；3．安徽医科大学第一附属医院麻醉科，安徽 合肥 230032)

肺癌(lung cancer，LC)是全球范围内最常见的癌症，并且发病率呈逐年上升的趋势。在过去的10年中，我们对肺癌的研究取得了突破性的进展，尤其是肺癌相关基因的研究。但纵使如此，肺癌仍是导致癌症死亡的首要因素。2018年，全球肿瘤流行病统计数据估算，有大约290万肺癌新发病例(占总肿瘤病例的11.6%)和176万死亡病例(占总肿瘤死亡病例数的18.4%)，这远远高于2012年报道水平[1-2]。根据肺癌的分化程度和形态特征，将肺癌分成小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。NSCLC中最多见的是鳞状细胞癌，其次是腺癌，还有一些少见的病理类型，例如腺鳞癌、大细胞癌、肺泡细胞癌等。

肺癌患者会发生一系列身体和心理上的问题，包括咳嗽、呼吸困难、疼痛和焦虑等，疼痛是最严重的症状之一，并且严重影响患者生活质量。世界卫生组织制定了癌痛三阶梯镇痛方案：第一阶梯是使用非甾体抗炎药物为主的镇痛药物；第二阶梯是使用弱阿片类镇痛药物；第三阶梯是使用强阿片类镇痛药物[3]。吲哚美辛则是属于第一阶梯镇痛药物，它是常用的解热镇痛药物，有口服、涂抹、直肠给药等多种给药途径，在临床上有广泛的用途。它是首批被批准用于疼痛治疗的非甾体抗炎药物之一，目前被认为是诱导早产儿动脉导管闭合的一线药物，具有极高的安全性。此外，吲哚美辛在治疗其他一些临床疾病中也具有很好的疗效，例如：肾脏痛和一些类型的头痛，但吲哚美辛在晚期癌症中的研究目前还是相对较少。

一氧化氮(nitric oxide，NO)是一种气体自由基递质，可调节机体的多种生物学功能。它是一种简单的气体自由基，其主要功能是通过cGMP作为细胞信号通路中的信使。在哺乳动物中，NO是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)合成的，NOS有3种亚型，分别是神经元中的NOS1(neuronal NO synthase，nNOS or NOS1)，可诱导的NOS2(inducible NO synthase，iNOS or NOS2)和内皮细胞中的NOS3(endothelial NO synthase，eNOS or NOS3)。关于NOS3的研究，之前主要集中在心血管疾病发生发展及治疗中的相关作用，NOS3表达异常和功能障碍与动脉粥样硬化发展密切相关[4]。不仅如此，NOS3促进生成的NO对预防糖尿病引起的内皮细胞功能障碍有着重要的意义[5]，但是NOS3在NSCLC中发挥着何种作用仍不清楚。

呼吸作用是生物最重要也是最基本的特征之一。线粒体参与多种重要的细胞活动，其中最为重要的是能量转换。在很多癌症中，由线粒体脱氧核糖核酸(mitochondrial deoxyribonucleic acid，mtDNA)突变引起线粒体呼吸链功能障碍导致电子泄露加剧，从而使自由基产生增加[6]。在大多数细胞中，线粒体复合物I和线粒体复合物III是细胞ROS的主要来源。在肿瘤细胞中，不断产生的ROS作为信使刺激肿瘤细胞增殖，并作为内源性DNA损伤因素，促进遗传变异和肿瘤的发展，因此，线粒体呼吸链在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。本研究通过人源NSCLC细胞系NCI-H520、A549，使用不同浓度的吲哚美辛，探讨吲哚美辛在NSCLC中发挥的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞 本实验选用NSCLC细胞系NCI-H520、A549，由上海派通生物科学有限公司提供。

1.1.2试剂 吲哚美辛、L-NMMA(NOS3抑制剂)购自美国Selleck公司；胎牛血清购自澳洲Gibco公司；0.25%胰酶消化液购自北京碧云天公司；DMEM/F-12细胞培养液购自美国Hyclone公司； ATP5A、UQCRC2、SDH8、NDUFB8复合抗体(批号：ab110413)购自英国Abcam公司；β-actin(批号：bsm-33036m)购自中国博奥森公司；MitoTracker Red CMXRos探针、ECL发光试剂盒购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 使用含有10%的胎牛血清的DMEM/F12高糖培养液，将NCI-H520置于37 ℃，含有5% CO2细胞培养箱培养，当细胞汇合度至80%时进行传代培养。

1.2.2CCK-8实验 将NSCLC细胞A549种植于96孔板，每孔接种约1×104个细胞，细胞培养12 h后，加入不同浓度吲哚美辛(0、5、10、20、50、 100 μmol·L-1)分别在0、12、24、48 h检测细胞增殖能力。再将NCI-H520肺癌细胞接种于96孔板，每孔接种约1×104个细胞，细胞培养12 h后，加入不同浓度吲哚美辛(10、20、30 μmol·L-1)，测定吲哚美辛对NCI-H520的抑制作用。确定吲哚美辛作用浓度后将NCI-H520、A549肺癌细胞接种于96孔板，使用不同浓度的L-NMMA(50、100 μmol·L-1)处理吲哚美辛预处理后的NCI-H520、A549细胞系，再测定细胞存活率，另设DMSO对照组，每组设置6个复孔。孵育24 h后，每孔加入100 μL CCK-8溶液，置于孵育箱孵育2 h后，使用酶标仪450 nm波长处测定各孔吸光度值(OD值)，计算各实验孔相对存活率。实验重复3次。

1.2.3克隆形成实验 取对数生长期NCI-H520细胞，以每孔约500个细胞接种于6孔板中，加入不同浓度的吲哚美辛(0、10、20、30 μmol·L-1)进行处理，放置于孵育箱中培养14 d，其中每3 d更换1次培养基。4%多聚甲醛固定后，使用0.2%结晶紫染色后进行拍照，每组设置3个复孔。

1.2.4Western blot实验 将NSCLC细胞NCI-H520接种于直径60 mm细胞培养皿，置于孵育箱培养12 h后，加入20 μmol·L-1吲哚美辛孵育 24 h，另设对照组。24 h后，取细胞培养皿，使用PBS冲洗2遍，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液，冰上裂解10 min，用细胞刮刮下细胞，置于EP管中。加入1/4体积的5×SDS-PAGE，沸水水浴10 min。取蛋白量约为20 μg的样品加入10% SDS-PAGE凝胶中电泳。随后进行转膜，在冰水中，电压100 V，100 min，使用湿法转膜方式将目的蛋白转至PVDF膜上。转膜完成后，5%脱脂牛奶常温封闭2 h，TBS洗涤3遍后，放置于已稀释的一抗中，4 ℃摇床孵育过夜。d 2，经TBS洗涤3遍后，置于二抗中，室温孵育1 h，使用ECL发光试剂盒进行显影，曝光后检测各蛋白条带的灰度值。

1.2.5免疫组化染色 组织样品购自武汉赛维尔生物科技有限公司，组织芯片产品编号：IWLT-N-52LN93，其中肺腺癌6例，肺鳞癌26例，癌旁组织20例。取出石蜡切片，置于烘箱烘烤2 h，使用PBS冲洗3遍，再用二甲苯浸泡20 min，一共浸泡3遍。然后使用无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇分别浸泡10 min进行水化。使用95 ℃柠檬酸钠缓冲液浸泡10 min，PBS浸泡2次，每次5 min。然后使用10%山羊血清进行封闭，置于湿盒室温孵育1 h。随后小心吸取封闭液，加入已稀释好的一抗(NOS3 1 ∶200)，4 ℃孵育过夜。次日室温复温30 min后，使用PBS洗涤3遍，每遍10 min，随后，使用3%的H2O2避光孵育15 min，再使用PBS洗涤3遍，每遍5 min。使用已稀释二抗室温孵育1 h后，使用DAB染色，置于流动的自来水冲洗2 min进行终止，再用苏木素进行复染。将玻片置于1%氨水中进行返蓝，再置于自来水冲洗2 min。最后使用二甲苯进行透明化5 min，封片后置于光学显微镜下观察。由于使用ImageJ plus无法精确区分肺泡和肿瘤组织界限，故采用人工打分方式，综合芯片结果，能够明显发现表达水平区别，因此未定量。

1.2.6生物信息学分析 本实验使用STRING网站对吲哚美辛配体进行预测，结合分数>0.8有意义；使用Discovery Studio模拟吲哚美辛与NOS3结合；通过GEPIA网站分析肿瘤和癌旁组织NOS3 mRNA表达水平、肿瘤切除术后NOS3 mRNA水平和远期生存率之间关系；通过LinkedOmics分析与NOS3富集的基因；使用KEGG分析与NOS3相关的通路。

1.2.7线粒体ROS水平 本实验使用MitoTracker Red CMXRos探针，将探针使用DMSO配置为1 mmol·L-1的储存液，加入处理后的肺癌细胞中，工作液浓度为100 nmol·L-1，孵育30 min。使用新鲜培养基洗去染色液，4%多聚甲醛固定后使用0.2%的Triton X-100进行透化，置于荧光显微镜下进行拍照。

1.2.8透射电镜 取5 μL处理后的细胞悬液，置于铜网，使用2.5%的戊二醛溶液固定后加入3%的磷钨酸室温复染5 min，吸取多余复染液，纯水洗涤3次，每次2 min，室温干燥，使用电镜拍摄照片。

2 结果

2.1 吲哚美辛通过NOS3抑制非小细胞肺癌细胞增殖通过CCK-8实验(Fig 1A)，结果发现相较于对照组，20 μmol·L-1的吲哚美辛作用24 h即可抑制NSCLC细胞A549增殖(P<0.05)，在48 h处理组中，发现吲哚美辛的抑制作用更稳定且十分明显。通过CCK-8、克隆形成实验(Fig 1B、C)实验发现，在NSCLC细胞NCI-H520中，20 μmol·L-1的吲哚美辛也具有抗癌作用以及抑制肿瘤细胞克隆形成能力。通过STRING网站预测吲哚美辛受体，结果发现NOS3与吲哚美辛有较高的结合分数(>0.98；Fig 1D、1E)。然后通过Discovery Studio进行分析，发现在NOS3蛋白内侧，存在吲哚美辛的结合域(Fig 1F)。于是我们使用了NOS3抑制剂L-NMMA进行处理，结果表明，在A549和NCI-H520 NSCLC细胞系中，相较于吲哚美辛处理组，50 μmol·L-1L-NMMA均可以逆转吲哚美辛引起的NSCLC细胞死亡(Fig 1G)(P<0.01)。以上实验表明，吲哚美辛抑制NSCLC细胞增殖，并且其抑癌作用与NOS3的活化相关。

2.2 吲哚美辛的作用靶点分析通过GEPIA数据库发现，相较于癌旁组织，NSCLC中NOS3 mRNA水平明显降低(Fig 2A)(P<0.05)。在切除病灶后，NOS3高表达的患者远期生存率较高(Fig 2B)。我们对NSCLC病患者的样本进行免疫组化染色，比较癌旁组织和NSCLC组织的NOS3表达水平，结果发现，NSCLC组织的NOS3水平明显低于癌旁组织(Fig 2C)。以上结果表明，NOS3在NSCLC的发展进程中起着重要作用。

2.3 NOS3与线粒体呼吸链高度负相关通过LinkedOmics数据库分析，NOS3可以富集20 103个基因(Fig 3A、B)。然后我们对NOS3富集得到的基因进行KEGG分析，发现线粒体呼吸链功能调控通路与NOS3有较高的负相关系数(Fig 3C、D)，因此我们考虑NOS3可能通过抑制线粒体呼吸链来发挥抑癌作用。

2.4 吲哚美辛抑制线粒体呼吸链活性为了检测线粒体功能，我们首先检测了线粒体ROS改变，通过MitoTracker Red CMXRos探针，结果显示相较于对照组，吲哚美辛处理组线粒体ROS明显增多(Fig 4A、B，P<0.01)，接下来我们通过透射电镜直观的观察线粒体的形态，结果提示吲哚美辛处理组线粒体数量减少、形态肿胀变形、內嵴消失(Fig 4C)。最后我们检测了ATP5A、UQCRC2、SDH8、NDUFB8四个线粒体复合物核心蛋白，通过Western blot实验，我们发现在20 μmol·L-1吲哚美辛作用下，相较于对照组，吲哚美辛处理组UQCRC2蛋白水平发生了明显的降低(Fig 4D)(P<0.01)，但ATP5A、SDH8、NDUFB8蛋白水平没有发生明显改变。这提示吲哚美辛可能通过UQCRC2影响线粒体呼吸链功能。

3 讨论

肺癌是世界上最常见、最致命的肿瘤之一，中国是世界上肺癌患者最多的国家之一，虽然肺癌治疗取得了极大的进展，但肺癌患者的生存率仍不容乐观。约有80%的肺癌患者患有肺鳞状细胞癌，且在确诊时已经是晚期，并伴有转移，预后不良[7]。因此，如何改善这类患者的生存质量是一个很值得探讨的问题。吲哚美辛是临床上常用的解热镇痛药物，之前很多研究表明，吲哚美辛不仅具有良好的解热镇痛效果，还具有一定的抗癌作用。在前列腺癌中，吲哚美辛激活未折叠蛋白反应和凋亡通路，促进p53蛋白表达，并抑制细胞周期、Myc基因表达和AR/ARV7通路[8]。在结直肠癌中，吲哚美辛可降低炎症因子水平，激活凋亡通路从而发挥抑癌作用[9]。不仅如此，负载阿霉素的吲哚美辛二聚体纳米颗粒在耐药乳腺癌可发挥抑癌作用[10]。然而，吲哚美辛在NSCLC中的作用，目前的研究甚少，而它却是肺癌中常用的解热镇痛药物。

Fig 1 Indomethacin inhibited proliferation of non-small cell lung cancer cells by

Fig 2 Drug target analysis of indomethacin

Fig 3 NOS3 was closely associated with mitochondrial respiratory chain

本实验采用人源NSCLC细胞系NCI-H520和A549，在不同的时间点使用不同的吲哚美辛浓度，发现20 μmol·L-1的吲哚美辛即可发挥抑癌作用。这一浓度远低于临床使用血药浓度，不会产生明显副作用。为了进一步探讨吲哚美辛抑癌作用的机制，我们使用了分子靶向对接技术，分析发现NOS3与吲哚美辛关系密切，并且使用了L-NMMA(NOS3抑制剂)验证了这一靶点。NOS3是一个比较有争议的分子，有研究指出NOS3能够参与NO的生成，而NO对肿瘤的进程有着重要的影响[11-12]。本研究对NOS3进行了进一步的探究，通过公共数据库GEPIA分析发现，相较于正常人，NSCLC患者NOS3 mRNA水平明显降低。不仅如此，在病灶切除后，NOS3高表达的患者远期生存率更高。对患者样本进行免疫组化染色，发现相较于癌旁组织，NSCLC组织中的NOS3蛋白水平明显减少。这一系列的结果提示，NOS3可以抑制非小细胞NSCLC的进展，并且是吲哚美辛发挥抑癌作用的关键靶点。接下来我们进一步探究NOS3是通过何种途径发挥抑癌作用，通过LinkedOmics数据库发现线粒体呼吸链在其中的作用最为重要。为了验证这一结果，我们检测了吲哚美辛作用后线粒体ROS水平、线粒体形态，而这些结果也与我们预想的结果一致。线粒体呼吸链核心蛋白水平是体现线粒体功能的一个重要指标，我们通过Western blot检测在吲哚美辛处理后线粒体呼吸链核心蛋白的表达情况，结果发现相较于未处理组，吲哚美辛处理组UQCRC2蛋白表达明显降低，而其他蛋白的表达量没有明显的变化，所以我们认为吲哚美辛发挥抑癌作用是通过NOS3抑制UQCRC2蛋白表达从而抑制线粒体呼吸链。

线粒体是重要的细胞器，控制着细胞存活和死亡，越来越多的证据表明，线粒体代谢和功能在肿瘤的发展和进程中必不可少，这使线粒体及其功能成为抗肿瘤的热门靶点。线粒体呼吸链由5种复合物(I-V)组成，它们传递电子并参与氧化还原反应。天然化合物帕普胺被证明可以抑制NSCLC细胞的ATP生成、引起线粒体功能障碍、消耗细胞内ATP和增加线粒体超氧化物合成[13]，从而诱导NSCLC细胞凋亡。UQCRC2是线粒体复合体III重要组成亚基。它可以通过微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)/UQCRC2轴调节上皮间充质转化促进胃癌的进展[14]。此外，在胶质瘤中，钙黏蛋白18(cadherin 18，CDH18)通过UQCRC2抑制胶质瘤细胞侵袭性并改变患者预后[15]。我们首次发现在NSCLC中，NOS3可以通过影响线粒体呼吸链发挥抑癌作用，它通过抑制NSCLC细胞线粒体中UQCRC2来发挥抑癌作用。有报道指出许多线粒体呼吸链抑制剂，例如二甲双胍、α-生育酚琥珀酸酯和3-溴丙酮酸酯等都可以通过破坏线粒体呼吸链复合物功能来杀死癌细胞[16-17]，这也与我们的研究相一致。

Fig 4 Indomethacin inhibited activity of mitochondrial respiratory

综上所述，吲哚美辛在人源NSCLC细胞NCI-H520以及A549中发挥着抑癌作用，其作用机制与调控NOS3水平，抑制线粒体呼吸链有关。临床上晚期NSCLC患者众多，而吲哚美辛作为常用的解热镇痛药物应用十分广泛，本研究从麻醉疼痛科医师和外科医师角度，在多种镇痛药物中希望选择一个相对具有优势的镇痛药物，不仅可以减缓疼痛，还具有一定的抗癌作用，为晚期NSCLC患者的临床镇痛药物选择提供了新的用药思路。

(致谢：本实验在安徽医科大学第一附属医院麻醉科实验室完成，感谢各位老师和同学的帮助。)