热休克蛋白70通过激活TLR4/MyD88/NF-κB通路参与肠道炎症

王权鹏，黄崇杰，曹伟兰，洪 滉，尹商羽，钱朦敖，刘长宝

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是以肠黏膜屏障功能受损、黏膜通透性增加为特征的非特异性慢性肠道炎性疾病，近年其发病率升高，但是目前炎症性肠病的具体发病机制仍不清楚[1]。热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）结构高度保守，通过分子伴侣作用介导蛋白质的转运和正确装配，调节靶蛋白的活性和功能，协助修复在炎症、应激状态下折叠结构改变的蛋白损伤[2-3]。有研究表明，HSP70参与慢阻肺、肾小管的炎症反应并起重要作用，但其在肠道炎症中的作用机制尚不清楚[4-5]。激活Toll样受体4 （toll-like receptor 4, TLR4）是触发促炎细胞因子释放的主要途径，本研究以过表达和低表达HSP70的Caco-2细胞为观察对象，研究HSP70与TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路的关系，探讨HSP70在肠道炎症发生发展中的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与试剂 Caco-2细胞系购自上海慧颖生物科技有限公司。DMEM培养基（货号11054-001）及胎牛血清（货号16400-044）购自德国Gibco公司，RIPA裂解液（货号P0013D）、BCA蛋白定量试剂盒（P0012）、EdU-555细胞增殖检测试剂盒（货号C0075S）购自上海碧云天生物技术有限公司，Western blotting实验中的HSP70、MyD88、P65、β-actin一抗抗体（货号10995-1-AP、23230-1-AP、14220-1-AP、20536-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司，TLR4一抗抗体（货号ab13556）购自艾博抗（上海）贸易有限公司，ECL试剂盒购自伯乐（中国）有限公司。TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒（货号9767）、PrimeScript RT试剂盒（RR047A）及TB®PreMix Ex TaqTMII试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Caco-2细胞用含有10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基在37 ℃、5%CO2的条件下培养，待细胞汇合度至培养瓶80%左右进行传代。

1.2.2 慢病毒感染 用完全培养基制备密度为3×104个/mL的细胞悬液接种到培养板中，37 ℃培养24 h，至细胞汇合度为20%～30%。更换新的培养基并加入相应的慢病毒感染增强液和病毒量。37 ℃培养12 h后更换为常规培养基继续培养。在感染72 h，通过荧光显微镜观察细胞的感染效率。然后用嘌呤霉素（2 μg/mL）筛选出感染成功的稳定细胞株，筛选时间超过7 d。根据所用的慢病毒不同将细胞分为HSP70过表达组、HSP70过表达阴性对照组、HSP70低表达组、HSP70低表达阴性对照组和空白对照组（未加慢病毒的Caco-2细胞）。

1.2.3 细胞炎症诱导 在DMEM中加入脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），使其浓度达到 1 µg/µL，取处于对数期的各组Caco-2细胞在37 ℃的含有5%CO2细胞培养箱中培养24 h，模拟炎症反应，未加入LPS刺激的细胞作为对照。

1.2.4 ELISA检测IL-1β及TNF-α水平 将各组细胞在4 ℃，以1000 ×g离心10 min，然后取等量上清液分装于EP管。根据制造商的操作说明，配置洗涤液、生物素化抗体工作液及酶结合物工作液来检测上清液中IL-1β及TNF-α水平。

1.2.5 定量PCR 用TaKaRa MiniBEST总RNA提取试剂盒提取Caco-2细胞的总RNA后，使用含有gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒反转录获得cDNA。基因的表达水平使用TB®PreMix Ex TaqTMII试剂盒进行荧光标记后，检测荧光表达，引物见表1。β-肌动蛋白为内源性参照，实验重复3次。对目的基因表达进行归一化处理，数据用 2−ΔΔCT方法进行分析。

表1 实时荧光定量PCR采用的引物序列

1.2.6 Western blotting 细胞培养皿中加入50 μL的RIPA细胞裂解液冰上裂解15 min。离心15 min，吸取上清液弃去沉淀。使用BCA法进行蛋白定量后，加入Loading Buffer后，在100 ℃下煮沸 10 min制备蛋白质样品。将15 μg蛋白上样至SDS-PAGE 凝胶孔中进行凝胶电泳后，60 V转膜2 h，用5%脱脂奶粉进行封闭后，依次孵育一抗和二抗，最后用ECL发光试剂盒进行蛋白条带显像，Gel Image System 进行拍照。以β-肌动蛋白为内参照，检测结果以灰度值表示。

1.2.7 EdU比色法 在6孔板中按照3×104个/mL的密度铺板。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，LPS组加入所需的脂多糖处理，对照组不加刺激处理等。配制EdU工作液及Click反应液。反应后用Hoechst 33342室温避光染色。洗涤后，用荧光显微镜在波长460 nm处观察并拍照。

1.3 统计学方法 使用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用方差分析，组间进一步两两比较用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达HSP70促进脂多糖诱导的炎症反应 LPS刺激Caco-2细胞24 h，各组IL-1β和TNF-α的mRNA表达量和蛋白含量较相应未加LPS组均有明显上升（P < 0.05），其中HSP70过表达组IL-1β和TNF-α的蛋白表达分别为刺激前的7.73和6.60倍，过表达阴性对照组为刺激前的5.44和6.22倍，而HSP70低表达组仅为刺激前的5.10、5.62倍（P < 0.05），说明炎症细胞造模成功。在LPS刺激后，与过表达阴性对照组相比，HSP70过表达组IL-1β和TNF-α的mRNA表达量分别升高0.57和0.59倍，蛋白含量分别升高0.22和0.31倍，差异均有统计学意义（P < 0.05）；与低表达阴性对照组比较，HSP70低表达组IL-1β和TNF-α的mRNA表达量分别降低0.18、0.13倍，蛋白含量分别降低0.27、0.20倍，差异均有统计学意义（P < 0.05）；与低表达组相比，HSP70过表达组的IL-1β和TNF-α的mRNA表达量分别为其1.87、1.94倍，蛋白含量分别为其1.77、1.57倍，说明过表达HSP70增强LPS诱导的的炎症反应，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

图1 各组细胞IL-1β和TNF-α mRNA表达和蛋白含量比较

2.2 过表达HSP70促进细胞增殖 LPS刺激24 h，各组细胞增殖率较相应未加LPS组均有明显上升（P < 0.05）；与过表达阴性对照组相比，HSP70过表达组的细胞增殖率为其1.41倍；与低表达阴性对照组比较，HSP70低表达组细胞增殖率为其0.69倍; 与低表达组相比，HSP70过表达组的细胞增殖率为其2.14倍，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

图2 各组细胞增殖率比较

2.3 过表达HSP70激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路 LPS刺激24 h后，与过表达阴性对照组相比，HSP70过表达组HSP70、TLR4、MyD88及P65的蛋白表达量为其1.68、1.34、1.66、1.27倍，mRNA表达量为其2.56、2.03、2.09、1.88倍，差异均有统计学意义（P < 0.05）；与低表达阴性对照组比较，HSP70低表达组HSP70、TLR4、MyD88、P65 蛋白表达量为其 0.89、0.68、0.82、0.77倍，mRNA表达量为其0.41、0.62、0.64、0.71倍，差异有统计学意义（P < 0.05）；与低表达组相比，HSP70过表达组蛋白表达量为其1.86、1.96、2.12、1.69 倍， mRNA 表达量为 6.05、2.98、3.02、2.46 倍，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

图3 各组细胞在LPS刺激24 h后TLR4/MyD88/NF-κB信号通路关键蛋白及基因表达的比较

3 讨论

肠道炎症是先天免疫和获得性免疫异常激活的结果，免疫激活、遗传、环境因素和肠道菌群改变等多种因素共同参与诱导了肠道炎症的发生发展[6-8]。自上世纪以来，从细菌和哺乳动物来源的热休克蛋白及其重组产物已经被学者证明是免疫系统的强大诱导剂，其中细菌来源的HSP60、分枝杆菌HSP65和HSP70可诱导促炎细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和 IL-12等的表达和分泌[9-11]，促使抗原提呈细胞释放一氧化氮（NO）和C-C趋化因子。研究表明，HSP70与肠道炎症发生有关，溃疡性结肠炎患者在患病期间表现出肠黏膜HSP70升高，经过治疗后其水平下降[12]。

Caco-2细胞来源于人克隆结肠腺癌细胞，具有微绒毛结构,并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，结构和功能类似于分化的肠上皮细胞。本研究通过慢病毒构建HSP70稳定表达的Caco-2细胞，并用LPS刺激Caco-2细胞模拟肠道炎性环境，结果表明增强HSP70表达可导致下游炎症因子IL-1β、TNF-α的表达和分泌增加。热休克蛋白还被认为是细胞程序性死亡的抑制剂，可以阻断半胱氨酸蛋白酶依赖凋亡的内在和外在途径[13]。有学者发现HSP70可以改善小鼠感染后肠易激综合征症状[14]，这可能与热休克蛋白诱导炎症免疫作用和调节细胞增殖相关。本研究进一步通过EdU实验对细胞增殖情况进行研究，发现HSP70表达增高具有促进肠道细胞增殖的作用，且在炎症环境中的细胞具有更高的增殖率。本研究结果显示，HSP70和炎症刺激虽然都可以使得细胞增殖率较对照组增高，但是两者之间并无相关作用，提示炎症刺激虽然可以导致Caco-2细胞增殖率增加，但可能并非通过调控HSP70表达起作用。

Toll样受体是一种先天免疫受体，TLR受体家族可以对入侵病原体的释放及物质结合产生促炎反应，LPS作为肠道细菌内毒素能通过诱导肠道TLR4表达改变肠黏膜屏障通透性[15]，从而触发MyD88信号级联反应。在该受体介导的通路中，适配蛋白MyD88通过其自身的Toll/interleukin-1 receptor（TIR）基序与受体TIR结构域结合，而其C末端的死亡结构域则将IL-LR相关激酶（IRAK）招募到复合物中，IRAK被自动磷酸化并从复合物中释放出来，与TNF受体相关因子-6（TRAF6）结合后激活NF-κB通路或MAP激酶级联，该机制与炎性肠病的病理机制相关[16-17]。有学者进一步证实TLR2 和TLR4及其辅因子CD14是HSP70的受体，参与疾病的发生发展过程[18]。本实验中通过慢病毒转染细胞调控HSP70的表达，发现在炎性细胞环境中调高HSP70表达后能诱导TLR4/MyD88/NF-κB信号通路产生激活效应，在一定程度上抑制HSP70的表达后， TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活强度明显降低。说明HSP70在炎性肠病中起上游激活作用，并通过TLR4信号通路发挥相应的作用。

综上所述，HSP70通过激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路促进炎症因子产生，参与肠道炎症反应。这一结果有助于揭示肠道炎性疾病发病的机制，并为临床上肠道疾病的诊疗提供新靶点。