玉红膏对2期压疮模型大鼠损伤及修复因子作用机制研究

王会杰，王建华，张宝楠，王 娜，徐 丹

由于压力或压力与剪切作用的结合而对皮肤或底层组织造成的局部损伤叫做压疮[1]，通常涉及到对软组织的损伤，包括上皮、真皮及皮下组织，例如脂肪和肌肉[2]。损伤的细胞和组织在恢复过程中通常存在恶性循环，即由压力触发的直接变形损伤，继而引起继发性炎症-水肿损伤，炎症反应导致缺血性损伤[3]。炎性细胞因子的富集在压疮的病因学中起主要作用，受压区域的组织损伤及相关基因的表达增加了白细胞介素1α(IL-1α)、IL-1β、IL1受体拮抗剂(IL1RA)[4-5]及肿瘤坏死因子(TNF-α)[6]等的浓度，促进组织损伤和细胞坏死[7]。

在创面恢复过程中，多种影响因子干预着肌肉的生长发育。生肌素（Myogenin）蛋白属于Myo D家族，在肌细胞分化为成熟肌细胞的过程中起着重要的调控作用，并且作用无法代替[8]。肌纤维的增生受肌球蛋白重链（MYHC）蛋白的影响，并且MYHC蛋白可以水解ATP为ADP释放能量，为肌肉收缩提供动力[9]。血小板-内皮细胞黏附分子CD31蛋白是免疫球蛋白超家族成员，它可以促进血管的生成，扩大血管内皮的表面积，使新生血管保持活跃[10]。玉红膏在各类疾病的临床应用中非常广泛[11]，本研究通过建立动物模型，探讨玉红膏在治疗压疮过程中对细胞炎性因子等表达水平的影响，并分析其作用机制，为临床治疗慢性创面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠40只，体质量（180～200）g，购自北京斯贝福公司；玉红膏购自天津市北辰区中医医院；磺胺嘧啶银软膏购自广东恒健制药有限公司；Masson染色试剂盒（批号BA4079）购自珠海贝索生物技术有限公司，伊红染液（批号G1120）购自北京索莱宝科技有限公司，苏木素染液（批号BA4041）购自珠海贝索生物技术有限公司，CD31抗体（批号AF6191）购自Affinity公司，Myogenin抗体（批号Ab124800）、MYHC抗体（批号Ab207926）均购自上海Abcam公司，压疮方法参照以往研究的铁磁加压造模法[12-13]。

1.2 动物模型制备及分组 将大鼠随机分为模型组、玉红膏治疗组、阳性对照组、空白组，每组10只。模型的制作：于大鼠后腿部做一深至筋膜长度约3 cm的切口，钝性分离组织，植入圆形铁片（直径15.0 mm，厚0.3 mm，重0.6 g，高压灭菌消毒），逐层缝合切口。每天肌注青霉素以预防全身感染（0.2 mL/只，连续3 d）。术后第4天在铁片相对应的皮肤上放置圆形磁铁以产生压力（直径15.0 mm，厚5.0 mm，重2.6 g，磁通量1500高斯，4 h/d，持续7 d）造成局部组织缺血。第8天为观察期，参考美国压疮学会2期压疮标准，肉眼观察到受压部皮肤红肿，按压局部小鼠有明显的疼痛感；病理学观察到部分皮层缺损伴真皮层外露，多灶状溃疡深达真皮，真皮层有中等量淋巴细胞浸润，较多的炎性细胞浸润，肌纤维水肿，间质增宽伴随部分断裂，提示造模成功。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 采用低流量生理盐水冲洗大鼠创面，玉红膏治疗组创面均匀涂抹玉红膏，阳性对照组创面均匀涂抹磺胺嘧啶银软膏，模型组与空白组给予等体积蒸馏水，不予敷料包扎，换药1次/d，连续给药14 d后处死，腹主动脉取血3 mL，3000 r/min分离血清，-80 ℃保存备用。取大鼠压疮部位皮肤（1 cm2），空白组取相同部位正常皮肤，在预冷生理盐水中漂洗以去除皮下脂肪及结缔组织。用不同浓度乙醇逐级脱水，浸蜡包埋，切片。1）HE染色观察组织形态：脱蜡至水，HE常规染色，封片镜检，镜下取3个视野观察。2）Masson染色观察胶原纤维：脱蜡至水，Bouin固定，Masson常规染色脱色，封片镜检，镜下取3个视野观察。

1.3.2 ELISA检测 血液样本离心后获血清，采用ELISA试剂盒检测血清中IL-1α、TNF-α含量，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 Western blotting检测 取大鼠疮疡部位皮肤及周围少量组织进行裂解，4 ℃下12 000 r/min离心，BCA定量测定蛋白浓度，变性后进行电泳。加入40 μg总蛋白，恒压80 V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压120 V至溴酚蓝到凝胶底部，200 mA开始转膜，转膜条件：CD31组200 mA，120 min后改为300 mA，15 min；Myogenin组200 mA，70 min；GAPDH组 200 mA，90 min；MYHC组 200 mA，120 min后改为300 mA，60 min。5% TBST室温封闭2 h，加入一抗稀释液CD31（1:1 000）/Myogenin(1:200)/GAPDH(1:1 000)/MYHC(1:2 000)，4 ℃孵育过夜。TBST充分洗涤，加1:50 000的HRP标记二抗，37 ℃摇床孵育2 h。电化学：ECL发光，X线胶片记录影像，图像分析仪定量分析条带。采用Quantity one 4.6.8软件对Western blotting实验结果灰度值进行分析。

1.4 统计学方法 数据使用SPSS 21.0软件进行分析，多组比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 玉红膏对大鼠模型局部创面皮肤病理结构影响 空白组的组织整体结构基本正常，可见毛囊、皮脂腺及大量的胶原纤维，胶原纤维未见明显的断裂、萎缩及肿胀，组织内未见明显的炎性细胞浸润。模型组的组织整体结构异常，胶原纤维内可见大量新生的毛细血管及少量炎性细胞浸润。玉红膏组的组织整体结构轻度异常，可见毛囊，少量胶原纤维萎缩断裂，肌间隙增大，间质血管充血，组织内未见明显的炎性细胞浸润。阳性对照组的组织整体结构基本正常，可见毛囊、真皮及大量的胶原纤维，胶原纤维未见明显的断裂、萎缩及肿胀，组织内未见明显的炎性细胞浸润。见图1、图2。

图1 大鼠创面处皮肤组织HE染色（200倍）

图2 大鼠创面处皮肤组织Masson染色（200倍）

2.2 玉红膏对2期压疮大鼠模型血清中TNF-α、IL-1α水平的影响 玉红膏组大鼠血清中TNF-α、IL-1α水平低于模型组水平，差异有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较均无统计学差异。见表1。

表1 各组大鼠血清IL-1α、TNF-α蛋白表达水平比较

2.3 玉红膏对2期压疮大鼠模型创面组织中Myogenin、CD31、MYHC蛋白表达的影响 相对于模型组，玉红膏组Myogenin蛋白明显增加（P<0.001）；与阳性对照组比较有所增加。玉红膏组CD31蛋白与模型组比较呈升高趋势（P<0.05）；但不及阳性对照组。玉红膏组MYHC蛋白表达相对于模型组明显增加（P<0.001）；与阳性对照组比较，有小幅增加。如图3、表2。

图3 各组大鼠创面组织Myegenin、CD31、MYHC蛋白表达

表2 各组大鼠创面组织Myogenin、CD31、MYHC蛋白表达水平比较

3 讨论

压疮的成因复杂，关于压疮预防、治疗及机制研究都经历了漫长的变迁。目前公认的主要成因为局部的压力导致了受压部位缺血缺氧，从而进一步导致组织坏死，形成溃疡。压疮每年影响着数百万人，导致了人类生活质量显著下降、个人和医疗保健系统成本高昂以及高发病率和高死亡率[14]。感染压疮发生时，若不能给予及时的护理，会导致并发症的产生，严重甚至危及生命[15]。玉红膏在外科各类创伤的恢复中有着长足的应用，可用于治疗慢性下肢溃疡、烧烫伤、骨科疾病等。

本研究中，2期压疮大鼠模型创面红肿、溃疡，可见坏死细胞，病理观察组织结构不清，大量胶原沉积，与正常皮肤相比具有显著性差异；玉红膏用药组局部皮肤红肿水泡、溃疡与模型组相比具有较大差异，病理观察发现肌纤维大量增生，炎性细胞浸润改善，肌纤维排列紧密，说明玉红膏在创面的组织结构恢复过程中有一定的促进作用。

虽然IL-1α在不同类型细胞中均有表达，但生理和病理条件下，内皮细胞和上皮细胞是IL-1α的主要来源，信号通路主要靠与IL-1RI受体结合后被触发，并且受多种酶的调控分泌，如钙蛋白酶、颗粒酶B、凝血酶，最终触发和增强炎症反应[16]。本实验结果显示，与空白组比较，模型组IL-1α水平显著升高(P<0.05)，说明压疮造模成功，该方法适用于2期压疮模型的构建。与模型组比较，玉红膏组的大鼠血清中IL-1α水平明显降低，说明玉红膏可以抑制大鼠模型IL-1α的产生；与阳性对照组比较，玉红膏组的大鼠血清中IL-1α水平升高，证明玉红膏可以抑制模型大鼠血清中IL-1α的水平，并优于阳性对照药物。

TNF-α是肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)的20个成员之一，主要由活性巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞等分泌，可被LPS、微生物抗原、免疫复合物、超抗原、IL-1等刺激活化[17]。通常感染、炎症、烧伤会触发TNF-α的产生机制，造成组织细胞的持续炎症与促凝血反应[18]。本实验中，与空白组比较，模型组TNF-α水平显著升高(P<0.05)，说明压疮造模成功，该方法适用于2期压疮模型的构建。与模型组比较，玉红膏组模型大鼠血清中TNF-α水平显著降低，说明玉红膏可以降低2期压疮大鼠模型TNF-α的水平；而与阳性对照组比较无统计学差异，提示玉红膏能降低大鼠模型血清中的TNF-α水平，从而促进压疮创面的愈合。

Myogenin蛋白对于肌细胞的分化具有重要意义，在中胚层细胞定向成为成肌细胞过程中表达并定向调控，进而促使成肌细胞分化为肌管，最终促使肌细胞增殖分裂[8]。肌球蛋白重链（MYHC蛋白）是衡量肌纤维生长增殖的重要参数，而肌纤维特性则决定了组织生长的状态[19]。CD31蛋白通常在血管内皮细胞、血小板、嗜中性粒细胞中表达，通过免疫、血管系统黏附、信号传导等生物功能的组合发挥作用。在皮肤炎症、心肌缺血再灌注损伤模型中，阻抗中性粒细胞及单核细胞的富集，降低炎症微循环损伤[20]。本实验中，玉红膏用药组中大鼠Myogenin蛋白、MYHC蛋白高度表达，均高于模型组，说明本实验中2期压疮大鼠模型造模成功。Myogenin蛋白、MYHC蛋白表达均高于阳性对照组，提示玉红膏有助于创面肌细胞的恢复，优于阳性对照药物。与模型组相比，玉红膏用药组CD31蛋白水平大幅度增加，说明玉红膏有助于创面微血管的产生，通过重建血液循环促进创面愈合。

综上所述，玉红膏可以通过抑制2期压疮大鼠模型炎性介质的大量释放，进而控制、减缓炎症反应。并且通过促进肌细胞增殖、微血管的产生重建血液循环，恢复创面皮肤，有一定的临床应用价值。