咖啡因对C57BL/6小鼠防脱发的实验研究

郭晓东，赵丽娟

（1.吕梁市中医院，山西 吕梁 033000；2.湖北省襄阳市谷城县第二人民医院，湖北 襄阳 441100）

0 引言

随着现在工作压力、生活压力等逐渐增加，不少人群都存在脱发的情况。生理性脱发指的是毛发在休止期时自然脱落，病理性脱发是由于各种因素导致每日脱发数量超过100根的现象，打破了头发生长的动态平衡，头发变得稀疏，甚至会出现秃顶的情况，不仅对容貌造成影响，也对人的心理和精神产生了严重的负担[1]。

迄今为止，FDA只批准口服非那雄胺与外用米诺地尔治疗脱发，但20%-30%的患者在治疗一段时间后仍旧没有好的疗效，而且会产生药物依赖性。咖啡因是一种天然的生物碱，主要来源是咖啡豆，其次是茶。有研究表明咖啡因可逆转睾酮对毛囊的生长抑制作用[2]，目前对毛囊和毛细血管的研究较少，本文旨在研究咖啡因作用在小鼠毛囊和毛细血管时对毛发生长的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物

60只近交系C57BL/6小鼠，雌雄各半，6~8周龄，体重15~20g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，[编号：SCXK(京)2012-0001]。饲养于中日友好医院临床研究所动物饲养室（SPF级），温度（22±1）℃，湿度（50±5）%，每日通风1次，小鼠有充足活动空间、正常饮食，适应性饲养2周后实验。

1.1.2 实验材料

治疗药物为1%咖啡因溶液（自配）；5%米诺地尔溶液（自配，生产批号，60mL）；RTPCR试剂盒、DNA Marker为日本TaKaRa公司产品；Trizol为美国Sigma公司产品；丙酸睾酮注射液（1mL:25mg，天津金耀药业有限公司，产品批号：国药准字H12020531）；小鼠CD34单克隆抗体试剂盒，为美国Biolegend公司产品。

1.1.3 主要仪器

正置荧光显微镜（广东艾斯拓鼎，型号：ASTD）；电子数显游标卡尺（桂林广陆，型号：211-102F）；皮肤毛发观察仪（南京倍宁，型号：BNPFMF-8001）。凝胶扫描（ThermoFisher E-Gel Imager凝胶成像系统）成像。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组

将小鼠按照随机数字表法将其随机分为4组，每组15只。分别为①空白组；②模型组（阴性对照组）；③1%咖啡因组（实验组）；④米诺地尔组（阳性对照组）。

1.2.2 动物模型的建立及干预方案

以平行脊椎为长轴，空白组皮下注射注射用油，其余三组皮下注射丙酸睾酮注射液，4组均1次/d，剂量为5mg/（kg·d）。造模次日进行干预，空白组不予处理，模型组涂抹生理盐水，咖啡因组与米诺地尔组涂抹给药，除空白组外，另外三组用棉签涂抹5min后使用生理盐水冲洗干净。每日定时给药1次，连续给药18d。

1.3 指标监测

1.3.1 观察结果

观察各时段各组小鼠的一般状态。从第4周开始收集小鼠脱落毛发；在相同条件下梳理小鼠背部毛发，随后用眼科镊收集脱落毛发并保存在自封袋中，测量脱发重量，用于小鼠脱发程度的考察。

1.3.2 HE染色

在涂药第7周，每组取3只小鼠观察区皮肤约2cm×2cm面积大小，进行常规组织脱水、石蜡包埋、切片、HE染色（苏木精-伊红染色），通过电子显微镜与NISElements BR软件联用，在显微镜下观察小鼠毛囊个数以及形态学变化。观察毛囊横断面和纵切面，制片时取同一水平面的皮肤横断面统计毛囊总数，每张切片取3个视野（100倍下）。

1.3.3 RT-PCR检测

提取总RNA 及 RT-PCR。脱毛后第7周取背部皮肤，Trizol法提取总RNA，采用DNA Marker试剂盒进行一步法RT-PCR。针对小鼠血管内皮细胞生长因子VEGF mRNA的特异性引物序列为5＇-CAGGCTGCTGTAACGATGAA-3＇及5＇-AATGCTTTCTCCGCTCTGAA-3＇，反应产物为266bp。针对小鼠肝细胞生长因子HGF特异性引物序列为5＇-CCATGAATTTGACCTC-TATG-3＇及5＇-ACTGAGGAATGTCACAGACT-3＇，反应产物为421bp。针对小鼠类胰岛素一号生长因子 IGF-1 特异性引物序列为5＇-CACACCCAGGAGGGGAACAG-3＇及5＇-GTGTTGTTGATGCTCCGTCC-3＇，反应产物为327bp。RT-PCR步骤按照 DNA Marker 试剂盒说明书进行，RT-PCR 产物在2%琼脂糖凝胶上电泳（100V，25min），溴乙啶染色。凝胶扫描（ThermoFisher E-Gel Imager凝胶成像系统）成像。

1.3.4 CD34免疫组化染色

CD34表达采用免疫组化法，操作步骤按试剂盒说明书进行。以抗CD34抗体标记显示血管内皮细胞，显微镜下每条棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表单独微血管。先于100倍视野内选择CD34标记的微血管密度高的区域，再在200倍视野内选取5个视野，取平均值（MVD）。

1.4 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料以均值±标准差（±s）表示，组间比较使用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠一般状态观察

给药组小鼠注射丙酸睾酮注射液后，有明显活动增加，并出现相互厮打现象。持续给药4周后，小鼠背部毛发呈灰暗颜色，持续给药6周后毛发脱落。咖啡因组和米诺地尔组比模型组脱落的毛发少，其中米诺地尔组最为明显，咖啡因组较为明显。

表1 各组小鼠脱发重量（n=15，±s）

表1 各组小鼠脱发重量（n=15，±s）

注：＊咖啡因组与模型组比较，t=9.673，P＜0.01，米诺地尔组与模型组比较，t=12.420，P＜0.01。#与米诺地尔组相比较，t=2.308，P＜0.05。

组别 脱毛重量（mg）空白组 10.6±1.62模型组＊ 26.6±2.33咖啡因组＊# 18.5±2.08米诺地尔组＊ 16.8±1.79

2.2 四组小鼠毛囊数量

HE染色后，于显微镜下观察毛囊纵切面及同一水平横断面。观察纵切面模型组毛囊稀疏，而咖啡因组与米诺地尔组毛囊密度较好。同一水平横断面比较各组毛囊数量，咖啡因与米诺地尔两组明显较模型组增多，差异具有统计学意义。小鼠毛囊数量比较，见表3。

表2 4组小鼠毛囊数量比较（n=15，±s）

注：＊咖啡因组与模型组比较，t=2.130，P＜0.05，米诺地尔组与模型组比较，t=5.332，P＜0.01。#与米诺地尔组相比较，t=3.254，P＜0.01。

组别 毛囊数量（个）空白组 75.4±10.18模型组＊ 34.3±10.85咖啡因组＊# 42.9±10.51米诺地尔组＊ 55.9±10.52

2.3 咖啡因对小鼠皮肤 VEGF mRNA 表达的影响

脱毛后第18天，咖啡因组、米诺地尔组在小鼠皮肤266bp处检测到VEGF mRNA 表达、模型组及空白组有轻微特异性条带，见图1。

2.4 咖啡因对小鼠皮肤 HGF mRNA 表达的影响

脱毛后第18天咖啡因组及米诺地尔组小鼠皮肤在421bp处检测到HGF mRNA 表达，空白组与模型组可见轻微HGF特异性条带，见图2。

2.5 咖啡因对小鼠皮肤 IGF-1 mRNA 表达的影响

脱毛后第18天咖啡因组及米诺地尔组小鼠皮肤在327bp处检测到IGF-1 mRNA 表达，空白组与模型组可见轻微IGF-1特异性条带，见图3。

2.6 免疫组化CD34测定小鼠脱毛区MVD

取平均值之后的差异性对比发现，咖啡因组与米诺地尔组对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。咖啡因组与空白组对比差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

脱发是一种由多因素引发的常见疾病，会造成抑郁、焦虑等多种心理问题，并对生活质量有巨大的负面影响，包括使一个人的自我意识增强、失去自信和降低自尊心等[3-4]。主要病因是雄性激素入血后，至头皮转化为毒性物质，使毛囊的能量和蛋白质代谢发生障碍，导致脱发。微循环是生命的基本特征之一，其发生障碍可导致血液流量下降，毛囊供血不足，发无生长之源而脱落[5]。迄今为止，非那雄胺和米诺地尔治疗20%-30%的脱发患者疗效不佳[6]，同时具有药物依赖性。

最近已有研究报道咖啡因的抗纤维化、抗炎和抗氧化活性[7]，同时观察到咖啡因在皮肤微血管中的作用，增强皮肤小动脉和毛细血管的微血管功能[8]。大量研究[9]表明局部使用咖啡因能够刺激毛囊生长，从而防止脱发。N.Otberg[10]等通过对6名男性志愿者使用咖啡因洗发水（Alpecin；Dr.Kurt Wolff GmbH）进行试验，研究结果表明在使用2min后，检测到咖啡因渗透到角质层和毛囊中，在使用2h后达到最高值。Rachita Dhurat[11]等研究发现在6个月时，使用5%米诺地尔溶液组的毛状图的生长期比值平均改善率为11.68%，而使用1%咖啡因溶液组的生长期比值平均改善率为10.59%，两组间均值差异为1.09%；意味着1%的咖啡因溶液可以达到防止毛发脱落的效果。同时研究发现使用0.2%的咖啡因溶液的头皮瘙痒基线有显著改善，而5%的米诺地尔溶液没有改善。因此，对于雄激素性脱发，基于咖啡因的局部液体效果不低于5%米诺地尔溶液，且不良反应事件较少。但是有研究[12]观察到使用较高浓度的咖啡因具有抑制作用，高浓度的咖啡因可能会导致毛囊处于高代谢状态，消耗大量能量后导致脱发。所以，在治疗脱发时要注意咖啡因的使用浓度，这也为后续研究提供新思路。

毛囊的正常发育和周期性循环取决于毛囊上皮与邻近的间充质真皮乳头的相互作用[13]。单个毛囊可分生长期、退行期和休止期[14]，而生长期对于新毛发的产生至关重要，其中毛发长度（未剪断）与生长期（头皮毛发：2-8年）的长度成正比[15]。从生长期到退行期的转变受维持生长的类胰岛素一号生长因子（IGF-1）的影响[16]。IGF-1是种胰岛素生长因子，能促进细胞的生长和增殖，同时也可以促进血管内皮生长。通过刺激IGF-I表达，可以促进毛囊的生长，抑制毛囊进入退行期，达到相对延长毛发生长期的目的[17]。因此，IGF-1的高表达有利于维持生长期。另一种研究较多的是利于维持生长期的生长因子，即血管内皮生长因子（VEGF），它是一种二聚体糖蛋白，可刺激血管生成。多项研究表明，VEGF可以促进头发生长，增加毛囊大小和头皮厚度。VEGF是可作用于毛囊的生长因子，其表达高低影响着毛囊周围血液微循环，VEGF表达增加能促进毛囊细胞新陈代谢和发育[18]。肝细胞生长因子（HGF）有多种功能，但其调节毛囊毛发生长的机制可能为：调节真皮乳头细胞和上皮角质形成细胞之间的相互作用；诱导毛囊周围血管的形成；影响毛囊的周期性循环[19]。CD34阳性细胞是毛囊循环再生的因素之一，用于评估皮肤的毛细管密度，其缺乏可能导致毛囊循环的中断，但其具体机理有待进一步证明和研究[20]。

综上所述，咖啡因对C57BL/6小鼠毛发、微循环血供的研究结果表明，1%咖啡因与米诺地尔皆可以减少小鼠毛发脱落，增加头皮毛囊数量，并增强VEGF mRNA、HGF mRNA、IGF-1 mRNA表达；增加毛细血管密度，最终达到防止小鼠毛发脱落的效果。