结直肠癌免疫微环境及免疫治疗策略的研究进展*

杨长江，赵龙，林易霖，叶颖江，王杉，申占龙

北京大学人民医院胃肠外科/北京大学人民医院外科肿瘤研究室/北京市结直肠癌诊疗研究重点实验室 北京 100044

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是严重危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤，目前已成为全球第二大癌症死亡原因[1]。结直肠癌传统的治疗方式包括手术治疗、化疗和放疗。近年来，通过重新激活宿主免疫系统对恶性肿瘤细胞杀伤能力的免疫治疗在肿瘤治疗领域取得了令人瞩目的成绩。其中，程序性细胞死亡蛋白1（programmed death protein-1，PD-1）、程序性细胞死亡配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）以及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）在晚期结直肠癌的治疗中已显示出显著的益处[2]。目前，纳武利尤单抗、帕博利珠单抗等ICIs已获批用于治疗DNA错配修复缺陷（mismatch repair-deficient，dMMR）及微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high，MSI-H）的转移性结直肠癌[3]。一般来说，无DNA错配修复缺陷（mismatch repair-proficient，pMMR）及微卫星稳定（microsatellite stable，MSS）患者的预后比dMMR/MSI-H患者差，且对ICIs治疗不敏感[4]。原因为pMMR/MSS患者的细胞毒性淋巴细胞浸润水平较低，难以产生有效的抗肿瘤免疫反应。了解结直肠癌免疫微环境中不同类型免疫细胞的浸润水平及其功能对于评估结直肠癌患者免疫治疗的预后，优化结直肠癌免疫治疗策略具有重要的意义[5]。本文回顾了结直肠癌免疫微环境中不同类型的免疫细胞的作用，并讨论了针对不同类型免疫细胞的潜在治疗方法，旨在更好地了解结直肠癌免疫微环境的组成及其作用，优化当前结直肠癌免疫治疗策略，提升免疫治疗效果。

1 结直肠癌免疫微环境的组成及其作用

结直肠癌免疫微环境的组成成分包括T细胞、B细胞、巨噬细胞及其相关信号分子等，不同类型的免疫细胞在结直肠癌的发生发展中发挥着不同的作用。

（1）CD8+T细胞：肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TILs）是结直肠癌免疫微环境的主要成分，主要包括T细胞和B细胞。T细胞是肿瘤免疫微环境中含量最丰富和最具特征性的免疫细胞，包括CD8+T细胞和CD4+T细胞。CD8+T细胞即细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），是适应性免疫的关键组成部分，同时也是抗肿瘤免疫反应的主要效应细胞。CTLs可识别肿瘤抗原，通过穿孔素、颗粒酶、Fas配体等直接杀伤肿瘤细胞，同时还可以分泌白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）以及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等进一步增强对肿瘤细胞的杀伤作用[6]。然而，不可忽视的是，肿瘤细胞为了逃避免疫攻击，可以通过表达免疫检查点分子、分泌白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等抑制性细胞因子等多种方式抑制CTLs对肿瘤细胞的杀伤活性[7]。PD-L1和PD-1是重要的免疫检查点分子，肿瘤细胞和基质细胞通过高表达PD-L1，与T细胞上的PD-1结合后，可以抑制T细胞活化，使杀伤性T细胞转变为耗竭性T细胞，失去对肿瘤细胞的杀伤作用，从而促进肿瘤的免疫逃逸[8]。CTLA-4在调节T细胞功能方面也发挥着重要的作用。它是一种跨膜蛋白，主要表达于活化的T细胞细胞膜表面，与B7分子结合后可向T细胞传递抑制性信号，诱导T细胞耗竭，靶向抑制CTLA-4可恢复T细胞的杀伤能力[9]。目前PD-1、PD-L1、CTLA-4已成为抗肿瘤免疫治疗的重要靶点。

（2）CD4+T细胞：CD4+T细胞可通过分泌多种细胞因子来调节其他免疫细胞的功能，在激活其他免疫细胞（B细胞、CTLs等）、调节免疫反应过程中起关键作用。CD4+T细胞可进一步分化为具有广泛功能的T细胞亚群，包括辅助性T细胞（helper T cells，Th cells）Th1、Th17细胞和调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）等。Th1细胞的主要功能在于激活CTLs等免疫细胞的效应功能，辅助杀伤肿瘤细胞，增强抗肿瘤免疫反应[10]。Th17则通过分泌如白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）、白细胞介素-21（interleukin-21，IL-21）和白细胞介素-22（interleukin-22，IL-22）等细胞因子发挥免疫抑制功能，促进肿瘤生长和转移[11]。研究发现，结直肠癌中较高的Th1细胞浸润水平与患者更好的无病生存率相关，而Th17细胞的浸润则与不良预后有关[12]。此外，CD4+T细胞中还包含一类经典的免疫细胞——免疫抑制性Tregs，这类细胞表达特征性分子叉头盒蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3），并且可通过抑制IL-2分泌、释放腺苷和分泌TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子来负调节免疫反应，促进肿瘤进展[13]。Katz等[14]通过免疫组化分析表明，较高的FOXP3:CD4和FOXP3:CD8比率与结直肠癌患者较短的5年总生存期（overall survival，OS）相关，是结直肠癌患者预后的独立预测指标。然而，近年来一些研究发现结直肠癌中FOXP3+Tregs较高水平浸润与较理想的无复发生存期和疾病特异性存活相关，FOXP3+Tregs较低水平浸润患者的预后较差[15]。这种矛盾可能来源于肿瘤免疫微环境中Tregs的异质性。Saito等[16]发现结直肠癌中Tregs可分为终末分化的免疫抑制亚群和促炎亚群，免疫抑制性Tregs浸润水平升高与结直肠癌患者较差的预后相关。

（3）B细胞：B细胞是体液免疫的主要效应细胞，可以通过分泌细胞因子、介导肿瘤抗原的呈递、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、激活补体等方式影响肿瘤的发展及其对免疫治疗的反应。Edin等[17]研究发现结直肠癌中较高水平的CD20+B细胞浸润与较低的病理分期和显著改善的疾病特异性生存相关，同时CD20+B细胞的浸润水平与CD8+T细胞的浸润水平呈高度正相关。此外，B细胞参与三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLSs）的形成，TLSs由CD20+B细胞、CD4+滤泡辅助性T细胞（T follicular helpers，Tfhs）和滤泡树突状细胞等构成[18]。越来越多的证据表明TLSs是一种有效的抗肿瘤免疫反应结构[19]。Posch等[20]通过对109例结直肠癌患者的肿瘤组织标本分析发现大部分患者肿瘤组织中可观察到TLSs，并且在dMMR/MSI-H结直肠癌肿瘤组织中更常见。此外，Posch等还发现TLSs的形成与较低的疾病复发风险和较好的预后相关，这表明TLSs在结直肠癌相关免疫反应及疾病进展中发挥重要作用。

（4）巨噬细胞：肿瘤免疫微环境中富含巨噬细胞，巨噬细胞被认为是实体瘤中浸润最丰富的免疫细胞群之一[21]。巨噬细胞主要通过肿瘤细胞释放的C-C 趋 化 因 子 （C-C motif chemokine， CCL）CCL2、CCL3、CCL4、CCL5等从外周募集[22]。肿瘤免疫微环境中巨噬细胞具有高度异质性，可分为具有促炎、免疫活化、抗肿瘤特性的M1型巨噬细胞及具有免疫抑制、促肿瘤特性的M2型巨噬细胞。Lee等[23]通过对232例结直肠癌患者肿瘤组织标本中巨噬细胞的预后预测价值分析发现M2型巨噬细胞浸润水平较高的患者的无进展生存期（progression free survival，PFS）和OS显著缩短。CD163是M2型巨噬细胞的特征性分子标志物，Wei等[24]研究发现，肿瘤侵袭前沿间质组织中CD163的高表达与上皮—间质转化、间质的循环肿瘤细胞比例及较差的预后相关。Yang等[25]基于对81例结直肠癌患者肿瘤组织标本的免疫组化分析发现M2型巨噬细胞浸润与较高的淋巴血管浸润、肿瘤侵袭、TNM分期以及较差的OS相关。就功能方面而言，M2型巨噬细胞可通过多种方式促进肿瘤的侵袭和转移。一方面，M2型巨噬细胞可通过促进细胞外基质重塑[26]、诱导上皮—间质转化[24]促进肿瘤的侵袭转移；另一方面，M2型巨噬细胞通过分泌VEGF促进肿瘤血管生成[27]，同时通过分泌免疫抑制性细胞因子IL-10和TGF-β促进肿瘤免疫逃逸[28]，最终促进结直肠癌的进展。

2 结直肠癌免疫治疗策略

（1）靶向T细胞的治疗策略：ICIs主要通过靶向阻断T细胞或肿瘤细胞表面的免疫检查点蛋白或配体来恢复机体免疫功能。目前研究最广泛的ICIs是靶向PD-1、PD-L1以及CTLA-4的抑制剂。帕博利珠单抗是靶向PD-1的ICIs之一，NCT01876511试验确定了其对结直肠癌的治疗作用。NCT01876511试验包括11例dMMR结直肠癌患者和21例pMMR结直肠癌患者，其中dMMR患者的免疫治疗相关客观缓解率和无进展生存率分别为40%和78%，pMMR患者分别为0%和11%。dMMR患者的中位PFS和OS未达到，而pMMR患者的中位PFS和OS分别为2.2个月和5.0个月[4]。KEYNOTE-164（NCT02460198）是一项评估帕博利珠单抗治疗难治性dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者的Ⅱ期临床试验。试验结束时，A组患者（既往接受≥二线治疗）的中位随访时间为31.3个月，客观缓解率为33%，中位PFS为2.3个月。B组患者（既往≥一线治疗）中位随访时间为24.2个月，客观缓解率为33%，中位PFS为4.1个月。A组与治疗相关的3～4级不良事件的发生率为16%，B组为13%。该试验证实了帕博利珠单抗对dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者的疗效，使得dMMR/MSI-H转移性结直肠癌率先进入免疫治疗时代[29]。KEYNOTE-177（NCT02563002）是一项Ⅲ期临床试验，评估了帕博利珠单抗单药一线治疗dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者的疗效。研究共纳入307例既往未接受治疗的dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者，并随机分配至帕博利珠单抗组或化疗联合靶向治疗组。结果表明帕博利珠单抗相较于化疗联合靶向治疗可显著改善初治型dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者的肿瘤缓解情况和PFS（16.5个月vs.8.2个月）。帕博利珠单抗已于2017年被FDA批准用于治疗不可切除或dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者。

另一种PD-1抑制剂是纳武利尤单抗。纳武利尤单抗在dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者中显示出良好的治疗效果。CheckMate 142试验旨在评估以纳武利尤单抗为基础的治疗对转移性结直肠癌患者的有效性和安全性。这项研究包含三个队列，其中一个队列是研究纳武利尤单抗单药用于标准治疗失败的dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者，在入组的74例患者中23例患者达到客观缓解，客观缓解率为31%。68.9%（51/74）的患者获得了＞12周的疾病控制，12个月无进展生存率和总生存率分别为50%和73%[30]。CheckMate 142试验的另一个队列研究内容是评估纳武利尤单抗和纳武利尤单抗联合伊匹木单抗治疗对于既往化疗失败的dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者的疗效。与纳武利尤单抗单药治疗相比，纳武利尤单抗联合伊匹木单抗免疫治疗对于接受过标准治疗的dMMR/MSI-H的复发性或转移性结直肠癌患者具有较好的安全性和显著的临床疗效[31]。此外，近期研究发现，一线使用纳武利尤单抗联合低剂量伊匹单抗具有强大而持久的临床益处，并且具有较好的耐受性，有望成为dMMR/MSI-H转移性结直肠癌患者新的一线治疗方法[32]。

（2）靶向巨噬细胞的治疗策略：鉴于巨噬细胞对肿瘤免疫调控的重要作用，靶向巨噬细胞已经成为免疫治疗的新热点，目前的研究已尝试多种靶向巨噬细胞的抗肿瘤治疗策略，包括抑制巨噬细胞募集和分化，逆转巨噬细胞促肿瘤表型和靶向巨噬细胞效应分子等[33]。由于肿瘤免疫微环境中的巨噬细胞主要表现为M2型，因此诱导巨噬细胞从M2型到M1型的极化被视为一种具有临床应用前景的治疗方法。Georgoudaki等[34]发现通过靶向抑制巨噬细胞表面受体（macrophage receptor with collagenous structure，MARCO）可以在结肠癌小鼠模型中将M2型巨噬细胞极化为M1型并诱导抗肿瘤活性。Halama等[35]发现靶向抑制C-C趋化因子受体5（C-C chemokine receptor type 5，CCR5）可以调节巨噬细胞从M2型向M1型极化发挥抗肿瘤作用，并在晚期难治性结直肠癌肝转移患者的Ⅰ期临床试验中得到证实。此外巨噬细胞集落刺激因子1（colony stimulating factor-1，CSF-1）在巨噬细胞分化和血管生成中起重要作用，目前以集落刺激因子1受体（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）抑制剂为代表的靶向巨噬细胞抗肿瘤治疗已经进入临床前阶段[36]。RG7155（emactuzumab）是一种人源化单克隆抗体，可与CSF1R结合并阻断其二聚化。在结直肠癌小鼠模型中，使用RG7155治疗可减少肿瘤组织中浸润的M2型巨噬细胞数量并升高CD8+T细胞浸润水平，提示使用RG7155治疗是一种有希望的靶向巨噬细胞的治疗方法[37]。笔者团队通过对接受CSF1R抑制剂治疗的小鼠进行单细胞测序发现SPP1+肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）可能是导致CSF1R抑制剂耐药的关键因素，抑制SPP1+TAMs活性或减少其数量可能是提升CSF1R抑制剂疗效的有效途径[38]。

（3）靶向B细胞的治疗策略：除T细胞和髓系细胞外，开发基于B细胞的免疫治疗策略对于结直肠癌治疗也有较好的临床应用前景。B细胞通过充当抗原提呈细胞、产生高亲和力抗体和分泌抗肿瘤细胞因子来支持抗肿瘤免疫反应并促进免疫治疗反应，因此增强肿瘤免疫微环境中抗肿瘤B细胞的活性可能是靶向B细胞免疫治疗的有效途径。笔者团队发现人膜联免疫球蛋白IgG1重链基因hIgG1-G396R突变可增强B细胞的活性，向结肠癌模型的小鼠体内过继输注hIgG1-G396R同源体，小鼠体内的高反应性B细胞可明显抑制肿瘤生长[39]。此外，近年有研究发现了一种在肿瘤免疫微环境中发挥抑制作用的B细胞——调节性B细胞（regulatory B cells，Bregs）。Bregs已被证明在抑制与肿瘤相关的免疫反应中发挥着关键作用[40]。Yarchoan等[41]发现使用丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抑制剂治疗可抑制Bregs活性，并减少结直肠癌小鼠模型中肿瘤引流淋巴结中的Bregs数量，但不影响抗肿瘤B细胞功能，从而增强抗肿瘤免疫力，这提示靶向抑制Bregs细胞功能可能是潜在的结直肠癌免疫治疗策略，但是仍需要进一步研究结直肠癌中Bregs细胞相关分子标志物，确定关键的Bregs靶点以提升治疗效果。

3 小结与展望

越来越多的证据表明免疫微环境在结直肠癌发生发展中发挥关键作用，是影响结直肠癌患者免疫治疗生存预后的重要因素。近年来，免疫治疗已成为肿瘤治疗领域的研究热点，包含ICIs在内的多种靶向免疫微环境的治疗策略已经在结直肠癌中取得了一定的成效。然而不可忽视的是，免疫治疗在结直肠癌中的疗效仍有待进一步提升。深入挖掘结直肠癌免疫微环境中不同类型免疫细胞的功能特性与关键分子，发现更多具有临床应用价值的治疗靶点，探索更优的联合治疗策略将有助于进一步提升免疫治疗的效果，同时指导临床医师对结直肠癌患者进行更加个体化的治疗。总之，肿瘤浸润免疫细胞在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用，随着免疫细胞在结直肠癌中的作用的不断阐明和更多治疗靶点的发现，将推动结直肠癌的免疫治疗向更加个体化、科学化的方向发展。

利益冲突声明全体作者均声明不存在与本文相关的利益冲突。