雷公藤甲素生殖毒性及其防治策略研究进展

李英奇，王 恒，李嫚琪，杨紫轩，许瀚林，常 艳

（1.上海工程技术大学化学化工学院，上海 201620；2.中国医药工业研究总院上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203；3.复旦大学药学院，上海 201203）

雷公藤甲素是一种二萜三环氧化物，可从雷公藤的根、叶、花及果实中提取，是雷公藤中最主要的生物活性成分，也是迄今发现的功能、活性较强的抗炎和免疫调节天然产物之一［1］。由于其在抗癌［2］、抗炎［3］和免疫抑制［4］等方面的良好作用，临床上已将雷公藤甲素用于治疗肿瘤［5］及类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）［6］和系统性红斑狼疮［7］等自身免疫疾病。然而，其对生殖系统、肝、肾、心脏和胃肠道等存在严重不良作用［8］，其中，生殖系统毒性主要表现为精子数量和活力下降［9］及卵泡凋亡［10］等。目前临床投入使用的雷公藤甲素单体制剂较少，常用的含雷公藤甲素的药物主要有雷公藤片和雷公藤多苷片等［11］，但不同厂家的药物中雷公藤甲素含量相差较大［12］，且生殖毒性和作用机制尚不明确，限制了其临床应用。因此，对雷公藤甲素的生殖毒性、作用机制和增效减毒措施的研究具有重要临床意义。

1 生殖毒性

雷公藤甲素的雄性生殖毒性主要体现在损害精子和睾丸细胞，及扰乱雄性激素等，其雌性生殖毒性主要体现在破坏子宫和卵巢的正常生理功能。

1.1 精子损伤

雷公藤甲素对生殖系统的影响之一是对精子的损伤。Ma等［13］报道，雄性小鼠ip给予雷公藤甲素60 μg·kg-12周后，小鼠附睾中精子数量减少。Wang等［9］ig给予雄性SD大鼠雷公藤甲素50和100 μg·kg-190 d后，大鼠精子密度和活力均显著降低。黄郑隽等［14］ig给予雄性Wistar大鼠雷公藤甲素25，50和100 μg·kg-130 d后，大鼠精子畸形率显著增加，精子头部发生明显畸形，表现出无头、细长型、无定型和无钩等类型。Xiong等［15］ig给予C57BL/6J小鼠雷公藤甲素50 μg·kg-135 d后，小鼠精子畸形率增加约45.75%。

1.2 睾丸细胞损伤

雷公藤甲素可在睾丸中显著累积，睾丸是其最主要的靶器官［16］。雄性小鼠ip给予雷公藤甲素60 μg·kg-12周后，小鼠睾丸生殖细胞明显脱落、减少［13］。Hu等［17］用雷公藤甲素20，40和60 nmol·L-1处理SD大鼠间质细胞，间质细胞活力下降并发生凋亡。Wang等［9］从SD大鼠睾丸分离支持细胞和生殖细胞进行共培养，与雷公藤甲素5，25，125，625和3000 nmol·L-1共孵育。结果表明，与细胞对照组相比，625和3000 nmol·L-1组支持细胞活力显著降低，支持细胞与生殖细胞的黏附连接被破坏，而5，25和125 nmol·L-1组未观察到显著差异。Zhang等［18］利用接近抗肿瘤剂量的雷公藤甲素（0.02，0.1，0.5和2.5 μmol·L-1）与小鼠支持细胞和小鼠精母细胞系（GC-2spd和GC2）共同孵育，结果表明，雷公藤甲素可使支持细胞和GC2的活力降低，并发生凋亡和自噬。Wang等［19］将小鼠支持细胞用雷公藤甲素 0.05，0.1，0.5，1 和 5 μmol·L-1处理24 h，发现雷公藤甲素可导致支持细胞收缩或失去黏附能力。

1.3 卵巢和子宫损伤

Zeng等［10］为确定雷公藤甲素25和50 μg·kg-1对卵巢功能的影响，在10 d内检测了NIH小鼠的发情周期，发现ig给予雷公藤甲素的小鼠发情周期延长，但发情期缩短。病理结果显示，雷公藤甲素组小鼠卵巢表面萎缩、苍白、粗糙，卵巢的初级卵泡、次级卵泡、原始卵泡和成熟卵泡数量减少。Tang等［20］ig给予19日龄雌性C57BL/6小鼠雷公藤甲素 30，60 和 90 μg·kg-1，发现小鼠子宫重量显著降低，HE染色见子宫上皮细胞变性和坏死。

2 生殖毒性机制

近年来随着对雷公藤甲素生殖毒性的研究，研究者们已发现多种雷公藤甲素生殖毒性作用机制，如引起细胞内氧化应激、损伤线粒体和破坏细胞骨架与细胞间的粘附连接等。

2.1 引起氧化应激和线粒体损伤

氧化应激和线粒体损伤是雷公藤甲素引发睾丸毒性的重要原因，并影响精子功能。Hu等［17］报道，雷公藤甲素诱导的氧化应激是引起睾丸间质细胞毒性作用的原因，与氧化应激相关的线粒体膜电位和细胞色素c（cytochrome c，Cyt-c）分别降低和增加。此外，凋亡相关的蛋白Bcl-2、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3表达，共同引发线粒体损伤，最终致使细胞凋亡。有关雷公藤甲素对支持细胞影响的研究很少，其毒性的分子机制尚不清楚。Wang等［19］报道了雷公藤甲素诱导睾丸支持细胞毒性的机制，发现支持细胞中的线粒体死亡介导睾丸毒性，而线粒体死亡是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）/c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途径激活和核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）途径抑制所介导，导致抗氧化系统失活，触发线粒体死亡，引发细胞凋亡。Cheng等［21］研究了线粒体功能和代谢与雷公藤甲素诱导支持细胞毒作用的相关性。结果表明，雷公藤甲素通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α〔peroxisome proliferator activated receptor（PPAR）-γ coactivator-1α，PGC-1α〕活性、抑制Sirtuin 1蛋白水平、调节丝裂原活化蛋白激酶水平，引发线粒体功能障碍，导致睾丸毒性。而线粒体损伤减少乳酸的产生，使脂肪酸代谢失调，导致生殖细胞能量不足，进一步导致睾丸毒性。

2.2 破坏细胞间肌动蛋白的黏附连接

支持细胞骨架是睾丸毒物的主要靶点之一，支持细胞中Rho家族的小分子Rho GTP酶可以调节细胞骨架和连接。Wang等［9］研究结果显示，雷公藤甲素通过抑制Rho GTP酶的表达，破坏细胞骨架以及细胞之间的黏附连接，导致精子功能障碍，是生殖细胞损伤的主要原因。为了明确潜在的调控途径，他们还检测了Rho GTP酶最重要的下游分子Rho相关激酶Rock的表达，结果表明，雷公藤甲素使Rock1和Rock2mRNA水平降低，提示Rho-Rock可能参与了生殖毒性的调节。

2.3 导致睾酮和关键酶水平下降

睾丸支持细胞和间质细胞标志酶分别为6-磷酸葡萄糖脱氢酶和β-葡萄糖醛酸苷酶，其活力水平会影响细胞的生理功能。线粒体标志酶琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）、溶酶体标志酶酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、生精上皮细胞标志酶乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和精子能量利用的主要酶腺苷三磷酸酶与生精能力、生精过程和精子运动相关。雷公藤甲素会使这些标志酶的活性明显下降，导致支持细胞和间质细胞损伤，从而可能导致睾酮分泌减少，损害生精功能，是雄性生殖功能损伤的一个重要机制［14］。Ma等［13］研究发现，雄性小鼠ip给予雷公藤甲素以60 μg·kg-1后，睾丸组织中的睾酮、SDH、ACP和LDH水平降低。

2.4 导致关键蛋白表达异常

雷公藤甲素还会引起某些蛋白表达异常，从而导致睾丸毒性。在睾丸中表达的乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）可以影响药物在睾丸中的分布，但其在雷公藤甲素诱导的睾丸损伤中的作用尚不明确。Li等［16］运用bcrp基因敲除FVB小鼠进行研究，发现雷公藤甲素会降低睾丸中BCRP mRNA和蛋白水平，进一步增加雷公藤甲素在睾丸中的含量，增强毒性作用。在细胞代谢调节中发挥重要作用的PPAR可能是导致精子功能障碍和支持细胞代谢异常的关键调控因子。Ma等［13］利用气相色谱-质谱联用技术从分子水平研究了小鼠给予雷公藤甲素后睾丸组织代谢物变化，发现雷公藤甲素可介导PPAR下调，使睾丸脂质和能量代谢异常，导致精子损伤。

雷公藤甲素的雌性生殖毒性机制也与蛋白质的表达异常相关。Zheng等［22］通过构建分子网络研究雷公藤甲素的雌性生殖毒性，发现半胱氨酸蛋白酶3、TP53和MYC靶向蛋白可以调控卵巢中21个蛋白的表达，是引起雌性生殖毒性的主要原因，但还需要在动物体内进一步验证。此外，卵巢中内质网应激相关蛋白表达上调，X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein）表达抑制［10］，雌激素受体 α和孕激素受体表达下调都是雷公藤甲素诱导的卵巢毒性的潜在机制［20］。

2.5 导致长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、环状RNA（circular RNA，cRNA）、mRNA和微RNA（microRNA，miRNA）表达异常

黄郑隽等［23］研究发现，凋亡基因Bax、Fas、FasL、胱天蛋白酶3及抑制凋亡基因Bcl-2和环腺苷酸反应成分调节蛋白的表达异常，很可能是诱导大鼠生殖细胞凋亡的重要原因。此外，还有一些RNA也可能与雷公藤甲素的生殖毒性相关。lncRNA和cRNA在内的非编码RNA是一种新型调控分子，与多种生理活动相关，对男性生育能力至关重要，然而是否与雷公藤甲素诱导的生殖毒性有关尚不清楚。Xiong等［15］通过RNA测序获得雷公藤甲素诱导的雄性生殖毒性小鼠的全基因组lncRNA、cRNA和mRNA表达谱，发现雷公藤甲素给药组小鼠睾丸中检测到部分lncRNA，cRNA和mRNA表达失调，提示其可能是雷公藤甲素诱导生殖毒性的标志物。为进一步研究特定lncRNA在雷公藤甲素诱导的GC2细胞毒性中的作用，Zhang等［18］选择Obox4-ps35（最显著上调的lncRNA之一）进行研究，发现敲除Obox4-ps35可以保护该细胞避免雷公藤甲素诱导的毒性，但仍需进一步研究阐明具体机制，并确定这种lncRNA调控的特定靶基因或信号通路。miRNA是一种小的内源性非编码RNA分子，参与细胞凋亡、分化和存活等过程。Han等［23］构建体外细胞模型研究生精障碍患者中显著上调的miR-200a在生精障碍中的调节机制。结果显示，miR-200a下调可保护间质细胞，也可通过触发自噬来改善雷公藤甲素诱导的小鼠睾丸间质细胞瘤细胞凋亡和氧化应激。

3 防治策略

雷公藤甲素具有抗炎、抗癌等药理活性，然而其生殖毒性限制了其临床应用。为发挥雷公藤甲素的临床应用价值，有必要对其生殖毒性缓解措施进行研究。目前主要包括研发雷公藤甲素缓解毒性药物、对其进行结构修饰及开发新型递药系统等。

3.1 寻找潜在的抗毒配伍药物

槲皮素是具有氧化应激保护功能的黄酮类化合物之一。Hu等［17］用雷公藤甲素（20，40和60 nmol·L-1）处理睾丸间质细胞24 h，引起明显的氧化应激；而将槲皮素（2.5，5，10和20 μmol·L-1）与雷公藤甲素联合给药24 h后，槲皮素 5 μmol·L-1可显著提高间质细胞活力，其作用机制与ROS减少、线粒体膜电位下降和Cyt-c释放减少、凋亡相关蛋白（Bax、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3）表达下调相关。Zhang等［24］研究也发现，靶向线粒体的抗氧化剂MitoQ（1.3，2.6和5.2 mg·kg-1）与雷公藤甲素120 μg·kg-1分别ig或ip给予雄性ICR小鼠14 d后，可以保护血睾屏障（blood-testis barrier，BTB）完整性、睾丸组织的微观结构和精子形态。MitoQ可激活肿瘤抑制因子Keap1-Nrf2抗氧化防御系统，上调线粒体融合蛋白2和动力相关蛋白1的表达，并对线粒体产生保护作用，进而抑制雷公藤甲素诱导的生殖毒性。

用于预防和治疗男性不育症的传统药用植物杜仲的活性成分桃叶珊瑚苷也可能缓解雷公藤甲素生殖毒性。Ma等［25］ip给予雄性小鼠雷公藤甲素120 μg·kg-1，1 h后ip给予不同剂量桃叶珊瑚苷（5，10和20 mg·kg-1，发现桃叶珊瑚苷可减少雷公藤甲素诱导的睾丸损伤、细胞凋亡、精子形态异常和BTB破坏。桃叶珊瑚苷通过抑制蛋白激酶R样内质网激酶/核转录因子和JNK途径预防凋亡，通过上调紧密连接蛋白（ZO-1，occludin和claudin-11）和间隙连接蛋白43的表达保护BTB的完整性。

含木犀草素的蔬菜和水果显示出对男性生殖系统的有益作用。Ma等［26］用木犀草素2.5，5和10 μmol·L-1与雷公藤甲素 500 nmol·L-1共同处理小鼠支持细胞，发现木犀草素可通过激活细胞氧化应激的重要转录因子Nrf2的转录活性并上调间隙连接蛋白43的表达，减少雷公藤甲素导致的睾丸损伤。

3.2 对化学结构进行修饰

对雷公藤甲素进行化学结构修饰可以降低其生殖毒性，提高其稳定性和治疗效果。Qi等［27］将雷公藤甲素结构修饰成雷公藤内酯氨基糖苷（triptolide aminoglycoside，TPAG），在治疗雄性昆明小鼠肾缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，IRI）的研究中，TPAG进入动物体内后24 h内保持稳定，与雷公藤甲素相比，可在更低剂量（0.22 mg·kg-1）有效治疗IRI。睾丸组织病理检测结果显示，TPAG组精子及间质组织形态正常，病理变化很小，而雷公藤甲素组生殖细胞严重退化、剥离，生精小管萎缩。Fu等［28］对雷公藤甲素进行结构修饰得到其衍生物ZT01，在治疗雄性C57BL/6小鼠炎症性肠病的研究中，ZT01在0.1，0.3和1.0 mg·kg-1可剂量依赖性改善炎症性肠病相关症状，治疗效果优于雷公藤甲素0.1 mg·kg-1，且降低了对睾丸的毒性，但ZT01的相关毒性和机制还需进一步研究。

3.3 开发新型纳米递送系统

使用纳米递送系统递送药物是一种有效降低雷公藤甲素毒性的方式，纳米递送方法不仅治疗剂量低于化学结构修饰方法，毒性也相对较低。Huang等［29］开发了负载雷公藤甲素的纳米颗粒（TP-F127/P123 nanoparticles，TP-FPNP），在雄性IRI模型小鼠上，TP-FPNP具有良好的肾靶向性，被肾小管细胞吞噬后，可缓慢释放雷公藤甲素，从而实现IRI治疗。该研究表明，TP-FPNP与雷公藤甲素相比，稳定性较好，且疗效显著、毒性较低。Deng等［30］开发了另外一种包封雷公藤甲素的纳米颗粒（triptolide-encapsulated mesoscale nanoparticles），在雄性IRI模型小鼠上，不仅肾靶向能力强，且在极低剂量（0.01 mg·kg-1）便具有良好疗效，与雷公藤甲素相比，生殖毒性较低。Zhang等［31］设计的半乳糖基化壳聚糖-雷公藤甲素-纳米颗粒（galactosylated-chitosan-TP-nanoparticles），在人肝细胞癌细胞系荷瘤裸鼠上显示出比雷公藤甲素更好的疗效，可有效抑制癌症发展，有效降低雷公藤甲素的雄性生殖毒性。Liu等［32］开发的雷公藤甲素负载纳米药物（TP-loaded nanomedicine，TP@NP），在Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型小鼠上表现出显著的软骨保护和抗炎作用，且TP@NP给药组小鼠子宫内膜厚度均匀，细胞核相对完整，接近正常小鼠。将RAW264.7细胞用雷公藤甲素40 nmol·L-1或TP@NP（含40 nmol·L-1雷公藤甲素）处理24 h后，TP@NP与游离雷公藤甲素相比，减少了细胞毒性和细胞凋亡。

4 结语

雷公藤甲素对生殖系统产生的不良反应主要表现为精子活力和生育能力下降、睾丸萎缩、睾丸细胞凋亡、卵泡数量减少和排卵功能损伤等，其毒性机制与氧化应激、线粒体损伤、细胞间肌动蛋白黏附连接破坏、酶（包括6-磷酸葡萄糖脱氢酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、SDH、ACP、LDH和腺苷三磷酸酶）活力下降及蛋白（包括BCRP、PPAR、胱天蛋白酶3TP53MYC靶向蛋白、连锁凋亡抑制蛋白、雌激素受体α和孕激素受体）表达异常等因素相关。针对雷公藤甲素的毒性作用，人们尝试用多种方法减轻其对生殖系统的损伤，如将其与缓解毒性药物联用、对其进行结构修饰、开发新型递药系统等。尽管取得诸多进展，但其生殖毒性及作用机制仍不十分明确，且其与缓解药物的实验剂量难以准确应用于临床；结构修饰和递送系统的研究目前也仅处于动物模型实验阶段。因此，还需进一步研究缓解雷公藤甲素不良反应并提高其药效的措施，以满足临床应用的需求。