大丽轮枝菌及其致病机制的研究进展

康立茹，刘 燕，杨永峰，王 永，王黎胜，刘湘萍，付崇毅，狄洁增，廉 勇，高 婧

(1.内蒙古自治区农牧业科学院蔬菜花卉研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；2.乌拉特中旗水利局，内蒙古 乌拉特中旗 015300；3.呼伦贝尔市农畜产品质量安全中心，内蒙古 呼伦贝尔 021000）

1 大丽轮枝菌的生物学特性研究

1913年Klebahn首次从萎蔫的大丽花上分离得到了一株轮枝菌，并命名为大丽轮枝菌。随着研究的不断深入，研究人员先后从棉花[1]、向日葵[2]、马铃薯[3]、茄子[4]、番茄[5]、生菜[6]等作物上都分离得到大丽轮枝菌，据统计其寄主植物已多达660种，其中农作物184种，观赏植物323种，杂草153种；包含锦葵科、菊科、葫芦科、茄科、豆科、十字花科等双子叶植物。综合分析，该菌菌丝体初期无色，后期加粗变褐，有隔膜，可以形成黑色微菌核。分生孢子梗轮枝状，无色、直立，2～4轮生，每轮3～7个小枝，辐射状。分生孢子着生在分生孢子梗的顶枝和分枝顶端，无色、卵圆形。微菌核由近球形的膨大细胞组成呈黑色，念珠状或葡萄状。大丽轮枝菌生长所需要的最佳温度为20~25℃，最适温度为22.5℃，当温度升高至30℃时，菌丝生长缓慢，温度高于35℃时停止生长，60℃为致死温度；大丽轮枝菌生长最适的pH值为7.0～8.0，最适pH值为7.5；该菌最适碳源为蔗糖，最适氮源为硝态氮；最适宜的土壤类型为壤土，且当土壤湿度小于30%时，随着湿度的增加，病原菌的生长速度加快；黑暗条件有利于大丽轮枝菌菌丝的生长，也有利于产孢。

2 大丽轮枝菌的侵染过程研究

大丽轮枝菌在不利条件下或者没有寄主存在时，病原菌以微菌核作为休眠结构在土壤中存活数十年，待条件适宜时即可萌发形成菌丝，菌丝由根部伤口侵入寄主根系，进入维管束后形成系统侵染，关于具体的侵染过程，不同寄主中存在一定差异，同一寄主的抗病和感病品种之间的差异非常显著，其中用到的主要方法是绿色荧光蛋白GFP标记病原菌，可在蓝色激发光下清晰可见[7]。如拟南芥[8]，接菌6 h分生孢子吸附在根表面，2～3 d到达皮层，9 d到达维管束，随后迅速扩展，11 d后完成系统侵染，并产生黄萎病症状。对于寄主棉花[9]而言，这一研究比较详细。同一菌株在对抗黄萎病棉花品种和感黄萎病棉花品种的侵染过程中，从孢子萌发、进入维管束时间等各个过程均推迟2～5 d不等，如分生孢子萌发时间，感病品种中吸附孢子24 h开始萌发，抗病品种中孢子萌发则在第5 d，推迟了4 d；再如菌丝进入维管组织时间在感病品种中是第7 d，在抗病品种中是第10 d，推迟了3 d；同样时间内抗感品种发病的严重程度也不同，接菌14 d后，感病棉株叶片已经产生萎蔫和褪绿症状，抗病品种只是子叶褪绿真叶毫无症状，茎基部分离到的菌落数也远少于感病品种。向日葵作为黄萎病的寄生对象，接种24 h孢子萌发，3 d菌丝突破表皮细胞造成内部侵染，菌丝在进入须根导管中需要5 d时间，若进入主根的导管则需要7 d。

此外，对大丽轮枝菌侵染过程研究有借鉴和指导意义的还涉及多种病原菌，多种作物，如枯萎病菌对香蕉的侵染[10]、枯萎病菌对向日葵的侵染、稻瘟病菌对水稻的侵染[11]、立枯丝核菌对马铃薯的侵染[12]等。王凯等人[13]研究了大丽轮枝菌在感黄萎病马铃薯品种云薯301中的侵染过程，认为24 h孢子萌发形成菌丝体，7 d菌丝扩展至根部皮层，14 d进入芽眼根的维管组织，3周茎基部观察到大量菌丝，这些菌丝可以横向生长进入相邻细胞，6～7周时，病原菌侵入至植株上部叶片、匍匐茎和块茎维管组织，10周后整株死亡。

3 大丽轮枝菌的种子带菌研究

众所周知，大丽轮枝孢菌常常以分生孢子或微菌核的形式通过病残体、发病土壤、耕作农具、灌溉水等传播媒介进行传播[14]。但随着大丽轮枝菌侵染过程的研究，更多的植物组织和器官可以被大丽轮枝菌侵染和定殖，由此成为病原菌的传播介体，其中跟随种子传播就是重要的途径之一，这也给病原菌的防控提供了一个新的挑战。如在棉花的种子传菌研究中，Gre M E等[15]对29份不同品种棉花种子带菌情况进行研究发现，不同品种带菌率存在一定差异，带菌率在0～29.8%，选取带菌种子再次种植，13周后植株出现典型的黄萎病症状。向日葵种子带菌研究比较详细，张园园[16]根据侵染过程观察和MNP-10培养基快速检测体系都证明了种皮、种壳可以携带病原菌，其中种皮是最重要的部位。在此之前，付剑桦[17]也证明了这一点，但是都没有发现种胚可以带菌。张贵等[18]同样研究过向日葵种子带菌情况，他首先以7个向日葵品种种皮DNA为模板,利用真菌通用引物ITS1/ITS4和ITS区内侧的黄萎菌特异引物进行巢氏聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR），证明了种皮携带黄萎病菌，随后用同样的方法对另外9个品种种子带菌情况检测，发现种皮带菌率在10%～25%。2005年Vallad GE等[19]对被大丽轮枝菌侵染的生菜植株进行收种，收集的种子，种子表面消毒后在NP-10培养基中鉴定带菌情况，部分品种种子带菌率高达90%，种子再次种植植株发病率在55%～80%。3年后他对种子带菌部位进行准确定位，在观察大丽轮枝菌在抗感生菜品种中侵染过程的研究中发现，生菜种子带菌部位主要有冠毛、果皮、被皮和胚乳，但是种胚不能被病原菌侵染而带菌。此外相关研究也证明了大丽轮枝菌可感染南瓜种子，带菌率在6%～28%，收获后的种子再次播种，有25%的幼苗携带大丽轮枝菌。大丽轮枝菌还可侵染茄子、番茄等多种作物种子，从而进行远距离传播。

4 大丽轮枝菌的致病机制研究

关于黄萎病菌的致病机制，历年来有多种解释，其中大多以“导管堵塞”和“毒素”两种学说为主。研究人员通过对黄萎病菌侵染棉花过程进行研究，发现含有菌丝、胶状物、侵填体维管束的数量与发病的严重程度正相关。研究还发现，橄榄被黄萎病菌侵染后，木质部结构发生了变化，菌丝体在维管束中繁殖，维管束中形成的侵填体以及聚集物堵塞木质部内腔，木质部的堵塞程度与叶片的发生的程度呈现正相关[20]。因此，早期的研究认为，黄萎病是因为导管被堵塞从而导致发病植株的萎蔫和坏死。也有学者发现，即使将茎部维管束切去一半，植物也不会萎蔫，而且被堵塞的导管数占整个维管束的比例较小，因此认为导管堵塞不是导致棉花萎蔫的主要原因[21]。随着研究的不断深入，人们认识到黄萎病菌产生的毒素可能是导致植物萎蔫的重要因素。还有一些学者认为，维管束的堵塞也是基于毒素的诱导效应[22]。

近年来，通过T-DNA随机插入突变、农杆菌介导的大丽轮枝菌转化（ATMT）等技术被广泛应用，黄萎病菌的一些致病相关基因相继被发现，如促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）VMK1基因、富含谷氨酸的蛋白VdGARP1基因转录调节因子Sgel基因等，这些基因可通过调控代谢途径、信号转导等途径响应病原菌的侵染。尤其是在基因突变的研究中发现，一些与微菌核产生有关的基因突变会导致其致病力的显著降低，如转录因子VdSge1、Vta、VdCrz1、VdMcm1；蛋白激酶VMK1、VdSNF、VdPbs2、VdPKAC1；葡萄糖代谢调节基因VdEg-1、VdHMGS、VdGPIM3等。张键[23]通过对VdOCH1、VdAAD2个基因的敲除和互补突变，认为这两个基因不仅与大丽轮枝菌细胞壁的完整性有关，还能够调节病原菌的生长发育、微菌核的形成、粗毒素分泌，从而影响大丽轮枝菌的致病力。刘轩[24]通过敲除大丽轮枝菌编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因Vd Sch9对该基因的功能进行研究，发现敲除突变体对于高渗透压、氧化还原压力、细胞膜完整性和细胞壁完整性等压力条件的敏感性增强。影响这大丽轮枝菌的生长发育及侵染过程。李俊娇[25]研究了大丽轮枝菌VdSho1的分子机制，认为该基因作为膜感受器参与感应细胞内外渗透压变化,进而通过调节菌丝内部黑色素的水平而提高病原菌穿透能力,最终调节大丽轮枝菌致病性。刘世超[26]对棉花大丽轮枝菌GH28家族成员VdEPG1的基因功能进行了研究，认为VdEPG1可能参与由GhOPR9介导的茉莉酸合成路径，诱导寄主免疫抗性,为后续棉花的抗病育种提供新的理论依据。